靜磁場通過促進骨重建和血管生成治療股骨頭壞死

王芮琦，張云龍，方彥雯，李心樂，4，衛敏，廖鐘財，張平，4，5

（1.天津醫科大學基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學系，天津 300070；2.天津醫科大學口腔醫院口腔綜合科，天津 300070；3.和也健康科技有限公司，安吉 313399；4.國家衛生健康委員會激素與發育重點實驗室，天津市代謝性疾病重點實驗室，朱憲彝紀念醫院，天津醫科大學，天津 300134；5.天津市脊柱脊髓重點實驗室，天津 300052）

股骨頭壞死（ON）是指由于股骨頭發生缺血、缺氧而引起骨細胞及骨髓壞死，導致股骨頭結構改變，最終使股骨頭塌陷的一種慢性疾病，是骨科領域一種常見的難治性疾病[1]。缺血性股骨頭壞死多發生于青壯年，致殘率高，是目前國內外研究的重點、難點[2]。研究表明，在股骨頭壞死發生時，由于組織內部缺血、缺氧，可能有利于成骨細胞和破骨細胞的活性變化，導致正常骨代謝進程被破壞，進而導致股骨頭壞死[3]。因此，調節壞死區成骨細胞和破骨細胞的活性，可能是延緩股骨頭壞死疾病進展的有效方法之一。

靜磁場也稱穩態磁場或穩恒磁場，是具有恒定磁感應強度和方向的磁場[4]。根據磁場強度，靜磁場可分為亞磁場（<5 μT）、弱磁場（5 μT～1 mT）、中強磁場（1 mT～1 T）和強磁場（>1 T）[5]。前期研究表明，中等強度靜磁場可用于臨床實踐，是直接治療損傷部位、疼痛、炎癥以及各種類型疾病的無創、安全、簡單的方法[6]。目前靜磁場已經廣泛應用于骨生物學研究，可以預防和治療骨質疏松癥、修復骨缺損、促進骨折愈合并減輕癥狀[7]。然而，靜磁場作為一種穿透性強且能量損耗低的物理治療方式，能否延緩股骨頭壞死的病理進程尚不清楚。本實驗采用將大鼠股骨頭圓韌帶切斷、縫線結扎股骨頸遠端，模擬股骨頭血供受損的股骨頭壞死模型，評估靜磁場對股骨頭壞死骨重建與血管生成的影響，為物理治療股骨頭壞死提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 45 只約12 周齡的SPF 級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重230～250 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供[生產許可證號：SCXK（京）2022-0002，動物批號：NO.111251221100144445]。每籠飼養5 只大鼠，飼養室光照-黑暗周期為12 h，溫度控制在25℃下，允許其自由攝取飼料和水。所有實驗根據天津醫科大學實驗動物管理規定進行，并經天津醫科大學倫理委員會批準［SYXK（津）2019-0004］。

1.1.2 主要儀器和試劑 數字化雙能X 線骨密度儀購自美國Norland 公司。石蠟切片機（RM255）購自德國Leica 公司。光學顯微鏡BX53 購自日本Olympus 公司。HE、MacNeal′s、TRAP 染料、β-actin 一抗均購自美國Sigma 公司。墨汁購自中國北京索萊寶公司。RUNX2、NFATc1 一抗均購自美國Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 45 只大鼠采用隨機數字表法分成為對照組（Sham 組，n=15）、股骨頭壞死組（ON 組，n=15）、股骨頭壞死靜磁場治療組（ONS 組，n=15）。如前所述進行股骨頭壞死造模[8-9]。用2%異氟烷麻醉大鼠，側臥備皮，以股骨大轉子為中心取髖部外側切口，分離皮下組織及肌肉層，打開髖關節囊并顯露股骨頭，隨后將髖關節脫位，切斷股骨頭圓韌帶，使用3.0 縫線結扎股骨頸遠端，使股骨頭血供受損，造成股骨頭缺血性壞死模型，雙側股骨頭同時造模（圖1）。隨后將髖關節復位，分層縫合肌肉組織、皮下組織和表皮。確保術中股骨頭完整分離、縫線結扎牢固，及時消毒清理術后手術器械，避免細菌污染。Sham 組在不破壞股骨頭解剖結構的前提下，切開后只分離臀大肌后縫合。術后3 d 內，給予大鼠1%的鹽酸丙嗎卡因和恩諾沙星（5 mg/kg）藥膏局部涂抹（1 次/d），分別緩解手術創傷所致疼痛和預防感染。

圖1 股骨頭壞死造模示意圖Fig.1 Schematic diagram of femoral head necrosis modeling

1.2.2 靜磁場治療 手術造模后第2 天，ONS 組接受靜磁場治療。在鼠籠底部放置定制的靜磁場設備治療4 周，每天持續24 h（圖2）。根據前期實驗的結果，選擇200 mT 為合適的靜磁場強度[10]。放置靜磁場后，允許大鼠在籠子中正?；顒?。Sham 組和ON組僅放置在鼠籠中，沒有靜磁場干預。

圖2 靜磁場裝置示意圖Fig.2 Schematic diagram of static magnetic field device

1.3 骨密度（BMD）檢測 在靜磁場治療后，使用2%異氟烷對大鼠進行吸入式麻醉，雙能X 線骨密度儀（pDEXA）檢測大鼠BMD，定位在大鼠雙側股骨頭，指標為BMD 和骨礦含量（BMC）。

1.4 組織學分析

1.4.1 組織處理 30 只大鼠（每組n=10）在造模后第4 周末進行人道主義處死。剝離大鼠后腿，剔除皮膚、軟組織及韌帶，保留完整股骨頭。將股骨頭組織置于10%中性福爾馬林中固定2 d，14%的EDTA中脫鈣5 周。將骨組織標本用石蠟包埋，冠狀位切片，厚度為5 μm。

1.4.2 HE、MacNeal′s、TRAP 染色 使用石蠟包埋的大鼠股骨頭標本（n=6），組織切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，進行HE、MacNeal′s、TRAP 染色，脫水透明后樹膠封片，顯微鏡下每張切片隨機選取5 個高倍視野，觀察組織病理形態學改變。使用Olympus CCD DP73 軟件進行骨小梁的面積/總面積、空骨陷凹率等相關數據的測量。

1.4.3 墨汁灌注 首先麻醉動物，將15 只大鼠在實驗結束后第4 周末（每組n=5）腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）進行麻醉。然后將大鼠四肢固定，用肝素生理鹽水灌注心臟（每只大鼠生理鹽水用量約為80 mL），直至灌注液可以從右心房造口處流出，保證流出液清亮時停止灌注。抽取墨汁灌注液并進行左心室灌注，保證灌注液能從右心房造口處流出，至大鼠皮膚黏膜全部變黑為止（每只大鼠灌注液用量約為100 mL）。灌注結束后，處死大鼠，將大鼠靜置于4℃過夜。保留股骨頭組織，脫鈣5 周后進行石蠟包埋并切片，切片厚度為25 μm。使用中性樹膠封片并在正置顯微鏡下觀察并測量單位面積內的血管面積。

1.5 Western 印跡分析 充分研磨股骨頭組織，在RIPA 裂解緩沖液中提取總蛋白。在4℃下離心10 min 去除雜質。采用一抗RUNX2（1∶1 000）、NFATc1（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）在4℃過夜孵育。二抗室溫（1∶20 000）孵育90 min 后，經化學發光后用凝膠成像系統檢測相關蛋白的表達并通過Image J軟件分析各組蛋白條帶的灰度值。

1.6 統計學處理 使用IBM SPSS Statistics 26 統計軟件進行統計學分析，并采用Graphpad Prism 7 軟件進行統計圖制作。符合正態分布的計量數據采用表示，多組間比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），組間多重比較行最小顯著差法（LSDt檢驗）。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 靜磁場增強股骨頭壞死大鼠的BMD 與Sham組相比，ON 組股骨頭壞死區域的BMD、BMC 降低（t=22.030、13.088，均P<0.001），而應用靜磁場治療4 周后，與ON 組相比，ONS 組大鼠股骨頭壞死區域的BMD、BMC 降低情況得到改善（t=-5.372、-4.584，均P<0.001，圖3）。

圖3 各組大鼠股骨頭骨密度的改變Fig.3 Changes in bone density of the femoral head in each group

2.2 靜磁場促進股骨頭壞死大鼠骨量的增加 在顯微鏡下，對HE 染色的股骨頭石蠟切片照相、分析骨小梁的面積/總面積（%），并觀察代表骨壞死形成的空骨陷凹。結果表明，與Sham 組相比，ON 組骨量明顯減少（t=1.352，P<0.001）；而靜磁場治療后，與ON 組相比，ONS 組骨量顯著增加（t=-4.038，P<0.001）。高倍鏡視野顯示：與Sham 組相比，ON 組視野內可見大量空骨陷凹（t=-6.662，P<0.001）；而經過靜磁場治療后，ONS 組比ON 組空骨陷凹數明顯減少（t=2.056，P<0.05，圖4）。

圖4 股骨頭HE 染色形態學檢查（40×，200×）Fig.4 Morphological examination of the femoral head by HE staining（40×，200×）

2.3 靜磁場促進股骨頭壞死大鼠的骨形成 Mac-Neal′s 染色結果顯示，與Sham 組相比，ON 組股骨頭的成骨細胞數/骨表面明顯減少（t=18.762，P<0.001），但靜磁場治療后，與ON 組相比，ONS 組成骨細胞數/骨表面顯著增加（t=-8.227，P<0.001，圖5）。與Sham 組相比，ON 組RUNX2 蛋白的表達水平明顯降低，而經靜磁場治療后，ONS 組比ON 組RUNX2 蛋白的表達水平明顯提高（t=12.080、-5.850，均P<0.05，圖6）。

圖5 股骨頭MacNeal′s 染色（400×）Fig.5 MacNeal′s staining of the femoral head（400×）

圖6 Western 印跡檢測各組RUNX2 表達Fig.6 Western blotting was used to detect the expression of RUNX2 in each group

MacNeal′s 染色結果顯示，與Sham 組相比，ON組股骨頭的成骨細胞數/骨表面明顯減少（t=18.762，P<0.001），但靜磁場治療后，與ON 組相比，ONS 組成骨細胞數/骨表面顯著增加（t=-8.227，P<0.001，圖5）。與Sham 組相比，ON 組RUNX2 蛋白的表達水平明顯降低，而經靜磁場治療后，與ON 組相比，ONS組RUNX2 蛋白的表達水平明顯提高（t=12.080、-5.850，均P<0.05，圖6）。

2.4 靜磁場抑制股骨頭壞死大鼠的骨吸收 TRAP染色顯示，與Sham 組相比，ON 組中破骨細胞數/骨表面明顯增加，破骨細胞異?；钴S（t=-9.803，P<0.001）；而與ON 組相比，ONS 組破骨細胞數/骨表面顯著減少（t=4.116，P<0.05），見圖7。采用Western印跡結果表明，ON 組股骨的NFATc1 表達量比Sham 組明顯增加（t=-6.033，P<0.001）；而靜磁場治療后，ONS 組比ON 組NFATc1 表達量顯著減少（t=3.618，P<0.05，圖8）。

圖7 股骨頭TRAP 染色（400×）Fig.7 TRAP staining of the femoral head（400×）

圖8 Western 印跡檢測各組NFATc1 表達Fig.8 Western blotting was used to detect the expression of NFATc1 in each group

2.5 靜磁場促進股骨頭壞死大鼠的血管生成 墨汁灌注實驗顯示，與Sham 組相比，ON 組血管面積明顯減少（t=7.389，P<0.001），而與ON 組相比，ONS 組血管面積減少得到顯著改善（t=-3.613，P<0.01，圖9）。

圖9 墨汁灌注實驗檢測靜磁場對大鼠血管生成的影響（100×）Fig.9 The effect of static magnetic field on angiogenesis was detected by ink perfusion experiment in rats（100×）

3 討論

股骨頭壞死又稱股骨頭缺血性壞死，是由于股骨頭缺乏血供而導致骨壞死的一種骨科疾病[11]。統計顯示股骨頸骨折、髖關節脫位、皮質類固醇類激素治療和酗酒是導致股骨頭壞死發生、發展的常見原因[12]。目前，股骨頭壞死的發病率逐年升高，已經造成了嚴重的社會和經濟負擔[13]。因此，找到有效治療股骨頭壞死的方法顯得格外迫切。

因為股骨頭壞死多發于青壯年，而置換的假體使用壽命有限，且青年人活動量大，容易造成假體松動，因此并不適合進行髖關節置換手術，臨床上進行早期診斷和治療可有效保護髖關節，延緩關節置換時間[14]。研究表明，靜磁場作為一種無創、安全且簡便的治療方式，可以通過促進成骨細胞增殖和分化，增加BMD、促進骨愈合、維持骨骼健康和治療骨骼疾病[15-16]。本實驗以股骨頭壞死大鼠為研究對象，探究靜磁場改善股骨頭組織骨重建與血管生成的機制，證實靜磁場通過增強成骨細胞的骨形成，抑制破骨細胞的骨吸收，增加血管生成，延緩股骨頭壞死。本結果與之前報道的靜磁場對骨骼、關節的有益作用相一致[17]。股骨頭塌陷可能與成骨細胞和破骨細胞活性的變化有關[18]。研究證明，骨壞死區內參與血管生成的內皮祖細胞功能發生障礙，死亡的細胞會釋放內源性炎癥因子，刺激破骨細胞的活化增加，導致組織進一步的損傷[19]。股骨頭壞死也會導致患者骨壞死區內骨髓干細胞和成骨細胞的功能下降[20]。在壞死區，骨修復差，參與骨組織修復的骨細胞增殖能力降低，破骨細胞活性增加，進而導致骨丟失[20]。因此，調節壞死區的成骨和破骨細胞活性可能是延緩股骨頭壞死進展的有效方法之一。在本研究中，與ON 組相比，靜磁場治療增加了股骨頭組織的骨量。MacNeal′s 染色顯示，靜磁場治療增加了股骨頭組織骨小梁表面成骨細胞的數量。TRAP染色顯示，經過靜磁場治療后，股骨頭組織骨小梁表面破骨細胞的數量減少。Western 印跡結果顯示，靜磁場治療增加了股骨中RUNX2 的表達，降低了NFATc1 的表達。另外，成功的血管生成可以有效刺激骨再生，而新生血管的減少會導致骨再生下降[21]。筆者之前的研究發現，機械加載作為一種動態力學刺激，通過周期循環的力學刺激和骨應力變化，引起骨髓腔內壓改變、骨質內液體流動與分子轉運，增加H 血管的表達，促進成骨，抑制破骨，影響骨髓間充質干細胞分化，調節血管生成，進而達到治療絕經后骨質疏松的目的[22-24]。但機械加載作用于體表，通過間接的方式刺激骨髓腔內壓改變、骨質內液體流動與分子轉運而發揮治療作用，且在轉化到臨床治療過程中，由于個體差異大，無法達到統一的作用效果，故仍有局限性。而靜磁場屬于靜態力學刺激，可以更直接的影響到深層組織細胞，更快發揮作用。且相關研究表明，靜磁場可以通過增強細胞活力，增加血管生成，促進傷口愈合[25]。故在此基礎上，本實驗擴展了之前的研究范圍，探究靜磁場對股骨頭壞死血管生成的作用機制。在本研究中，墨汁灌注實驗顯示，靜磁場治療可以增加股骨頭組織內血管的生成。這與靜磁場治療可促進血管生成的結果相一致[26]。

綜上所述，本研究表明靜磁場可以作為股骨頭壞死的一種新的治療方法，創新性地證實了靜磁場對促進成骨細胞的骨形成、抑制破骨細胞的骨吸收從而改善骨重建并增加血管生成的治療效果。但是本研究還有不足之處，如靜磁場對股骨頭骨壞死區域內血管微環境的調節，延緩骨壞死的具體機制還需要進一步探究。