蝦青素通過自噬改善快速老化小鼠心臟組織損傷

靳可青，劉銀玥，王萌，張緒梅

（天津醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，天津 300070）

隨著我國老齡化程度加劇，由年齡導致的心血管事件的發生率和嚴重程度也顯著增加，為老年人的生活和健康帶來了極大的負擔。心臟衰老與心血管疾病的發生、發展密切相關。衰老心肌的細胞生物學變化主要表現為心肌肥大和纖維化、蛋白質錯誤折疊和功能失調以及線粒體積累[1-3]。尋找延緩心肌細胞衰老的有效方法對防治年齡相關的心血管疾病的發生、發展具有重要意義。

蝦青素是一種酮式類胡蘿卜素，在海洋生物、藻類、真菌及少數植物中廣泛存在[4]。近年來，蝦青素已被證明具有廣泛的生物效應，例如抗氧化、抗炎和抗腫瘤特性[5-7]。研究發現，蝦青素通過上調和激活沉默調節蛋白1（SIRT1）對高脂飲食誘導的大鼠心臟損傷和纖維化具有保護作用，但蝦青素對衰老過程中心臟損傷的影響及具體的調控機制尚不清楚[8]。

研究顯示，蝦青素在多種不同疾病模型、組織中均具有調控自噬的能力[9]。自噬是一種進化上保守的過程，可通過降解細胞器和細胞質蛋白來響應各種形式的應激（如氧化應激）從而維持細胞存活。在健康生理狀態下，自噬能夠限制錯誤折疊的蛋白質積累、線粒體功能障礙和氧化應激，從而調節心臟穩態和保護心臟功能。3-MA 是經典自噬抑制劑，被廣泛應用于自噬研究，Wu 等[10]研究發現，3-MA下調了白細胞介素-33（IL-33）誘導的自噬，導致內質網應激和細胞凋亡增加，減少了IL-33 對糖尿病小鼠心臟舒張功能的保護作用。Sun 等[11]發現，3-MA 通過抑制自噬預防阿霉素誘導的心臟毒性。在衰老心臟中，自噬活性通常會降低，從而影響心臟的結構和功能[12]。因此，增強自噬可能是延緩心臟衰老和預防心臟疾病的一個可能靶點。本研究旨在通過使用不同劑量的蝦青素對快速老化小鼠進行干預，觀察蝦青素對衰老心臟組織形態的影響，進一步探討自噬在蝦青素延緩心臟衰老過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 AstaReal A1010 蝦青素由湯臣倍健公司提供；3-MA 購自Sigma-Aldrich；兔抗β-actin 抗體、兔抗Beclin 1 抗體、兔抗LC3 抗體購自美國CST公司；山羊抗兔二抗、BCA 蛋白定量試劑盒、蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購自中國思科捷公司；丙二醛（MDA）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、Masson 染色試劑盒購自中國索萊寶公司。

1.1.2 儀器 倒置熒光顯微鏡（IX81）（日本OLYMPUS 公司）；電泳儀、ChemiDocTM XRS 成像系統（美國Bio-RAD 公司）；酶標儀（奧地利TECAN 公司）；高速低溫離心機（德國sigma 公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及干預 64 只雄性6 月齡、SPF 級的SAM 小鼠，購自天津中醫藥大學附屬醫院[許可證號：SYXK（京）2019-0002]，包括8 只SAMR1 和56 只SAMP10 小鼠。小鼠于南開大學附屬醫院動物實驗中心飼養。在干預之前進行1 周的適應性喂養。本實驗已獲天津醫科大學動物倫理委員會批準（倫理審批號：IRM-DWLL-2019063）。根據不同的目的，實驗分組如下：第一批正常對照組（con-R1）、模型對照組（con-P10）、低劑量蝦青素組[AST L（0.4 mg/（g·d）]、中劑量蝦青素組[ AST M（0.8 mg/（g·d）]、高劑量蝦青素組[AST H（1.6 mg/（g·d）]、第二批模型對照（con-P10）、中劑量蝦青素組（ASTM）、中劑量蝦青素+抑制劑組（AST M+3-MA）。AstaReal A1010 蝦青素溶于橄欖油中每天通過灌胃干預小鼠3 個月，con-R1 和con-P10 每天灌胃同等量的橄欖油。3-MA（1.5 mg/kg）于處死前5 d 起每天腹腔注射。

1.2.2 樣品制備

1.2.2.1 血清樣品 小鼠干預結束后，頸椎脫臼法處死前，股動脈取血放入3 mL 促凝采血管中，3 000 r/min離心15 min 后取上層分離出血清，儲存于-80℃冰箱。

1.2.2.2 石蠟切片 將小鼠心臟組織完整取出（每組4 只），立即浸泡在4%多聚甲醛中，進行固定48 h左右，在梯度酒精中脫水，分別為：75%，1 h；80%，1 h；95%，2 h；100%，5 h。浸泡于二甲苯中使其透明化，3 次，每次10 min。用56～58℃溶解的石蠟包埋組織，冷卻。將包埋好的腦組織蠟塊按冠狀位方向用自動切片機切片，每張厚度約為5 μm。

1.2.2.3 心臟組織樣本 小鼠干預結束后，頸椎脫臼法處死后，將小鼠心臟組織分離并放于凍存管中，液氮中速凍后于-80℃冰箱儲存。

1.2.3 HE 染色 根據制造商說明，將石蠟切片脫蠟水化后，蘇木素染液染色5～20 min，沖洗后用伊紅染液染色30 s～2 min，沖洗后脫水、透明、封片、鏡下觀察拍照。

1.2.4 Masson 染色 根據制造商說明，將石蠟切片脫蠟水化后，用Weigert 鐵蘇木素染色液染色5～10 min，酸性乙醇分化5～15 s 后用Masson 藍化液反藍3～5 min。沖洗后用麗春紅品紅染液染色5～10 min，放入苯胺藍染色液中染色1～2 min。沖洗后脫水、透明、封片、鏡下觀察拍照。

1.2.5 氧化指標檢測 按照SOD、MDA 試劑盒的說明書，檢測小鼠心臟組織和血清中MDA、SOD 活性。操作過程均參照相應檢測試劑盒說明書進行。

1.2.6 Western 印跡檢測心臟組織LC3 和Beclin-1的蛋白表達 心臟組織加入裂解液后使用超聲儀勻漿提取蛋白，通過BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE 電泳，并轉移到PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。再加入LC3、Beclin-1 抗體（1 ∶1 000）和β-actin 抗體（1 ∶1 000）4℃過夜。TBST 清洗后加相應二抗室溫孵育1 h，使用Chemi-DocTM XRS+成像系統進行觀察，Image J 2.0 軟件進行定量分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0 軟件對數據進行統計分析，當數據滿足正態分布及方差齊性時，采用單因素方差分析進行多組比較，若多組間存在顯著性差異，進一步組間比較采用SNK-q或Dunnettt檢驗。方差不齊或不滿足正態分布采用Kruskal-wallis秩和檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蝦青素對SAMP10 小鼠心臟組織形態和心肌纖維化的影響 HE 染色可見，con-R1 組心肌結構清晰，細胞排列整齊。con-P10 組心肌細胞腫脹，排列疏松，細胞間隙增大，成纖維細胞增多，膠原纖維增生明顯。蝦青素干預組與con-P10 組相比，小鼠心肌細胞均有所改善，且AST H 組心肌細胞排列較整齊，纖維完整。

Masson 染色結果顯示，con-R1 組心肌細胞間膠原纖維網完好，分布均勻。con-P10 組心肌細胞間膠原纖維排列紊亂、分布不均，膠原纖維增生明顯。蝦青素干預組與con-P10 組相比，小鼠心肌組織纖維化減少，且AST H 組膠原纖維增生減輕更明顯，見圖1。

圖1 心臟組織HE 染色和Masson 染色Fig.1 HE staining and Masson staining of heart tissue

2.2 蝦青素對SAMP10 小鼠血漿以及心臟組織氧化應激水平的影響 與con-R1 組比較，con-P10 組血漿和心臟組織MDA 水平顯著升高（F=23.73、9.43，均P<0.05），而SOD 活力顯著降低（F=7.04、14.81，均P<0.05）。與con-P10 組相比，蝦青素干預后，P10小鼠血漿和心臟組織MDA 水平顯著降低（均P<0.05），而SOD 活力顯著升高（均P<0.05），見圖2。

圖2 小鼠心臟組織以及血漿MDA 和SOD 水平Fig.2 MDA and SOD levels in mouse cardiac tissue and plasma

2.3 蝦青素對SAMP10 小鼠心臟組織自噬蛋白表達的影響 與con-R1 組相比，con-P10 組心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1 蛋白表達顯著降低（F=13.73、15.38，均P<0.05）。與con-P10 組相比，蝦青素干預后小鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1 蛋白表達均增加（均P<0.05），見圖3。

圖3 Western 印跡檢測LC3 和Beclin-1 蛋白表達Fig.3 Expression of Beclin-1 and LC3 detected by Western blotting

2.4 蝦青素通過自噬改善SAMP10 小鼠心臟組織纖維化 與AST M 組相比，AST M+3-MA 組心肌細胞腫脹，排列疏松，細胞間隙增大，成纖維細胞增多，膠原纖維增生明顯，心臟組織和血漿中MDA 升高，SOD 活力降低，自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1 表達降低（F=18.75、6.353、15.77、14.08、22.83、8.657，均P<0.05），見圖4。

圖4 AST 通過自噬改善SAMP10 小鼠心臟組織纖維化Fig.4 AST improves cardiac tissue fibrosis in SAMP10 mice by autophagy

3 討論

快速老化小鼠能夠在較短時間內達到衰老狀態，是研究衰老相關問題的優勢模型，SAMP 小鼠與許多人類衰老相關疾病的生物學改變相類似，而SAMR 亞系的各項生理指標及存活期限與正常小鼠相類似，大量相關SAMP 不同品系研究均以SAMR系作為正常對照[13]。本研究發現SAMP10 小鼠心肌細胞排列疏松，細胞間隙增大，成纖維細胞增多，膠原纖維增生明顯。蝦青素干預改善了心臟組織衰老的表現，表明蝦青素可以延緩心臟衰老。

自噬是一種內源性自我保護機制，是維持心臟穩態和功能的主要調節因子[14]，并且在心臟衰老過程中逐漸減少，這表明自噬的下調是心臟衰老進展的基礎[15]。越來越多研究表明，激活自噬可能改善心臟衰老，延長壽命。Eisenberg 等[16]研究發現，給老齡小鼠口服亞精胺能夠顯著提高心臟的自噬水平，改善心肌肥厚，增強舒張功能，延緩心臟的衰老，進而延長壽命。自噬的關鍵成分Beclin-1 和LC3 是常用的自噬標志物，Beclin-1 是第一個被發現的哺乳動物自噬蛋白，也是第一個確定的哺乳動物必需酵母自噬基因Atg6 的同源物[17]，Beclin-1 的缺失會削弱自噬活性，上調Beclin-1 的表達可誘導自噬。當自噬啟動時LC3Ⅰ會被水解，轉變為LC3Ⅱ，結合在自噬小體膜上，LC3II/LC3Ⅰ的比值可反映自噬水平。本研究中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1 在心臟衰老過程中被下調，而在蝦青素干預后顯著增加。加入自噬抑制劑后，蝦青素誘導的自噬被部分抵消，且改善心肌組織結構能力減弱，表明蝦青素可以誘導衰老心臟自噬水平上調，且自噬對于蝦青素改善衰老心臟結構和功能，延緩衰老至關重要。

氧化損傷是一些衰老相關疾病病理的主要原因，累積的氧化損傷往往在細胞大分子中普遍存在，引起細胞的蛋白質結構和功能改變、脂質過氧化、RNA 降解和DNA 斷裂[18]。特別是持續作用于心臟組織，后者更容易發生氧化損傷。氧化應激可促進心臟組織纖維化[19]。蝦青素有強大的抗氧化作用，有研究發現其能夠改善心肌組織的氧化應激[20-21]。MDA作為脂質過氧化物的標志物，常用來評價機體氧化應激和氧化損傷程度，本研究發現蝦青素會顯著減少SAMP10 小鼠心臟組織和血漿MDA 的含量，增強SOD 活性。這些結果表明蝦青素主要是通過增加抗氧化酶和減少脂質過氧化來改善衰老的心臟組織纖維化。蝦青素是海洋動物產生的一種類胡蘿卜素，具有很強的抗氧化活性，作用機制是猝滅單線態氧，清除自由基對脂質過氧化的作用[22]。自噬是一種分解代謝過程，通過清除自由基改善細胞微循環，從而達到抗衰老的效果[23]。本研究用自噬抑制劑3-MA 加中劑量蝦青素進行干預，顯示3-MA 可降低中劑量蝦青素對衰老心臟氧化損傷的改善作用，表明蝦青素改善的SAMP10 小鼠心肌組織氧化應激水平可能部分是由自噬介導的。然而，關于蝦青素誘導心臟組織自噬的具體作用機制，還有待進一步研究。

綜上，本研究發現，衰老會導致小鼠心臟組織損傷、心肌組織纖維化、氧化應激水平增高以及自噬降低。蝦青素會改善SAMP10 衰老小鼠心臟組織纖維化，氧化應激以及自噬抑制，從而保護心臟組織。同時，本研究證明了蝦青素改善的SAMP10 小鼠心肌組織氧化應激水平降低部分是由自噬介導的，為有關蝦青素的抗衰老產品的開發應用提供了依據。