RA滑膜成纖維樣細胞外泌體促進巨噬細胞向M1極化

虞珊珊,李 靜,徐 臻,成 宇,宗 明,范列英

(同濟大學附屬東方醫院檢驗科,上海 200120)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性增生性滑膜炎、侵蝕性關節炎為主要表現的自身免疫病,我國大陸地區的RA患病率約為0.28%[1]。其特征性病理變化為關節滑膜炎癥細胞浸潤、滑膜成纖維細胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)異常增生、血管翳形成,病變的滑膜組織分泌大量炎性細胞因子及酶類侵蝕關節軟骨和軟骨下骨質,造成關節不可逆性破壞、畸形和功能喪失[2]。FLS在介導RA的直接組織損傷和疾病的持續發展中發揮著至關重要的作用[3],可分泌IL-6、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等細胞因子[4-6],影響微環境中其他免疫細胞如單核細胞[7]。單核細胞在關節局部活化為巨噬細胞(macrophage,M?)后通常分為經典活化型(M1)和替代活化型(M2a、M2b)。M1具有很強的吞噬免疫清除功能,可分泌TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12等參與促炎及抗原呈遞。M2a可分泌TGF-β、VEGF、制瘤素等發揮抗炎、促進傷口愈合和組織修復功能。M2b則分泌大量IL-10和少量IL-12,發揮免疫抑制、控制炎癥反應的作用。目前通常認為在RA關節滑膜組織中存在M1過度激活,同時M2數量和功能不足,是滑膜炎難愈的主要因素[8],其具體機制仍未完全明確。

1 材料與方法

1.1 一般資料

滑膜組織取自2020年6月—2022年10月于同濟大學附屬東方醫院風濕免疫科就診的RA患者關節鏡手術切除和常規病理檢查后剩余的滑膜組織。PBMC從健康志愿者全血中分離,研究經同濟大學附屬東方醫院醫學倫理委員會批準(倫理批準號:No.2020 tjdx),且均取得患者的知情同意。

1.2 試劑與儀器

RPMI 1640培養液購自美國Corning公司;胎牛血清、青霉素、鏈霉素混合液購自美國Gibco公司;M-CSF購自美國Sigma公司;無外泌體血清購自美國SBI公司;聚丙烯離心管、超速離心機購自美國Beckman公司;透射電子顯微鏡購自日本日立公司;納米顆粒跟蹤分析儀來自普邁生物科技有限公司;CD9、CD63抗體購自美國Abcam公司;實時熒光定量PCR儀來自ABI公司;電泳儀購自美國Bio-Rad公司;RIPA裂解液、BCA試劑、抗體稀釋液購自碧云天生物技術有限公司;TRIzol試劑購自Invitrogen公司;miRNA反轉錄試劑盒購自廣州銳博生物技術有限公司;正置熒光顯微鏡購自Leica公司;流式微珠陣列(CBA)流式術檢測IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12P70、INF-γ、INF-α、TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-6和IL-8共12項炎癥因子試劑盒購自杭州賽基生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CBA法檢測細胞因子 收集RA和OA關節液或細胞培養上清液,1 000×g,離心20 min,轉移上清液至新的離心管。使用細胞因子檢測試劑盒按照說明書操作,于流式細胞儀器上檢測并分析結果。

1.3.2 免疫組織化學法染色 將滑膜組織樣本制成石蠟切片,將切片脫蠟脫水。用3%H2O2室溫孵育10 min以清除內源性過氧化物酶。加20%山羊血清室溫封閉1 h后,加一抗(CD9)4 ℃過夜,加入相應二抗室溫孵1 h,加DAB顯色。顯微鏡下觀察切片,陽性部位呈棕褐色,細胞核呈藍色。

1.3.4 FLS上清液外泌體提取和分析 FLS以2×105/mL的密度接種于10 cm培養皿中置于5%CO2、37 ℃培養箱過夜培養,更換為含10%無外泌體血清1640培養液,置于培養箱繼續培養48 h;收集細胞培養上清液于50 mL離心管中,4 ℃,300×g離心10 min,以去除懸浮細胞,轉移上清液至新的離心管;4 ℃,2 000×g離心10 min,以去除死細胞,轉移上清液至新的離心管;4 ℃,10 000×g離心30 min,進一步離心去除細胞碎片;使用天平稱重法絕對配平后放入超高速離心機,100 000×g,4 ℃離心60 min;小心去除上清液,加入無菌PBS清洗離心獲得的外泌體,100 000×g,4 ℃離心60 min;小心去除上清液,加入無菌PBS于冰上溶解外泌體。

1.3.6 Western印跡法 在外泌體中加入等體積細胞裂解液,使用移液器吹打數次,于冰上裂解10 min,14 000×g離心10 min。上清液液中的蛋白質樣品立即收集,BCA法測定蛋白濃度。取30 μg總蛋白用10% SDS-PAGE膠分離后轉移到PVDF膜。在含5%脫脂奶粉的PBS封閉2 h后,使用一抗稀釋液稀釋一抗(CD9、CD63)4 ℃下孵育過夜,隨后使用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育,洗滌后滴加ECL化學發光液,于化學發光成像系統中掃描。

1.3.7 PBMC分離 采用EDAT抗凝管收集健康志愿者血液,使用等體積PBS對比稀釋。稀釋后的全血緩慢加入淋巴細胞分離液上層,于室溫400×g,離心30 min。小心吸取中間云霧層單個核細胞層細胞(PBMC),加入配制好的紅細胞裂解液5 mL,輕輕吹打混勻靜置5 min,室溫300×g離心5 min。棄上清液,用3 mL的PBS洗滌液重懸細胞,室溫300×g離心5 min。重復洗滌1次,棄上清液,加入完全1640培養液重懸PBMC。

1.3.8 M?誘導 PBMC以每孔2×104個接種于24孔板中,加入100 ng/mL C-MSF,放入5%CO2、37 ℃培養箱中培養6 d,隔天更換新的培養液并補充100 ng/mL C-MSF,細胞完全貼壁,即M?,用于后續的實驗。

1.3.9 RT-PCR檢測 外泌體刺激M? 48 h后,抽提RNA并反轉錄為cDNA。反應條件為:95 ℃,30 s,95 ℃,5 s,60 ℃,34 s,40個循環,熔解曲線分析:95 ℃,15 s;60 ℃,1 min;95 ℃,15 s。結果處理:每個檢測均作3個復孔,計算復孔Ct值的平均值,ΔCt表示目的基因相對表達拷貝數(ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值),計算2-ΔΔCt表示實驗組目的基因的表達相對于正常對照組目的基因變化倍數。引物序列見表1。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 關節滑膜液中細胞因子表達情況

收集6例RA及6例OA患者關節滑液標本,通過CBA法檢測滑液中IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-1β、IL-17、IL-10、IFN-α、TNF-α、IL-12P70、IFN-γ共12種細胞因子表達情況。結果顯示,RA患者關節液中M1型炎性細胞因子IL-1β(P<0.05)、IL-6(P<0.001)、IL-8(P<0.05)及M2型炎性細胞因子IL-10(P<0.05)水平均顯著高于OA患者,IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IFN-α、TNF-α、IL-12P70、IFN-γ在兩組中均含量較低,差異無統計學意義,見圖1。

圖1 CBA法檢測RA、OA關節液中細胞因子的含量

2.2 RA和OA滑膜組織CD9表達情況

免疫組織化學染色法檢測6例RA和6例OA患者關節滑膜組織外泌體標志物CD9的表達,結果顯示RA組滑膜中CD9分子明顯高表達,見圖2。

圖2 免疫組化檢測RA和OA滑膜組織CD9表達情況

2.3 外泌體鑒定

分離培養滑膜原代RA-FLS和OA-FLS,并收集細胞培養上清液,通過多次離心去除死細胞、細胞碎片及大囊泡后,經超速離心法獲得外泌體。Western印跡法和NTA方法鑒定外泌體;Western印跡法結果顯示,外泌體特異性表面標志物CD9、CD63均可被檢測到,見圖3A。NTA結果檢測顯示外泌體直徑大小集中在100 nm左右,見圖3B,RA-FLS提取的外泌體濃度顯著高于OA-FLS(P<0.05),見圖3C。

圖3 外泌體鑒定

2.4 RA-FLS外泌體對M?極化的影響

使用OA-FLS和RA-FLS來源外泌體刺激M?,通過RT-PCR和CBA法檢測M?極化分子mRNA和細胞因子水平。結果顯示,相比于OA-FLS外泌體,RA-FLS外泌體刺激M?后,M1極化標志物TNF-α、CCR-7、NOS-2 mRNA均明顯上調表達(P<0.05),而M2a極化標志物TGF-β mRNA明顯下調表達(P<0.05),M2b極化標志物IL-10 mRNA表達明顯上調(P<0.05)。在細胞因子水平,RA-FLS外泌體明顯促進M?分泌IL-6(P<0.001)、TNF-α(P<0.05)、IL-8(P<0.05)分泌,但對IL-10(P>0.05)分泌無影響,其他細胞因子無分泌,見圖4B。上述結果表明,RA-FLS所產生的外泌體主要促進M1極化,對M2的無顯著影響。

圖4 RA-FLS外泌體對M?極化的影響

3 討 論

M?在組織局部受到不同刺激后分化為M1和M2,在RA的發病和慢性持續炎癥進展中起著重要作用。本研究發現,在RA患者關節液中存在明顯高水平的包括IL-1β、IL-6、IL-8在內的M1型細胞因子,同時M2型細胞因子IL-10水平也顯著高于OA組。外泌體在細胞和組織之間廣泛表達,并在細胞與細胞間相互作用及基因調控中發揮作用,與M?極化密切相關[17]。通過免疫組織化學法發現,在RA滑膜中外泌體標志物CD9顯著高表達,提示RA關節滑膜局部可能存在較高濃度外泌體。RA-FLS是RA滑膜的關鍵組成細胞,分離培養原代RA-FLS,并提取其上清液外泌體,通過粒徑分析及Western印跡法檢測顆粒大小以及其表面特異的蛋白標志物CD9和CD63,證實采用超速離心法可有效分離RA-FLS細胞上清液外泌體。

以往對RA-FLS外泌體進行的研究發現,通過改變RA-FLS外泌體中miR-486-5p含量,可調節Tob1/BMP/Smad信號通路促進成骨,在RA的治療中具有一定前景[18]。本研究發現,相較于OA-FLS,RA-FLS分泌的外泌體濃度更高,采用人外周血單個核細胞誘導的M?進行體外實驗,證實RA-FLS外泌體具有更強的誘導M?向M1分化的功能,進一步揭示了RA-FLS在RA發病及滑膜慢性炎癥中的作用,其下游信號通路有待進一步研究。以往研究表明,外泌體中包裹大量miRNA,并可通過外泌體在細胞間轉運并在功能上影響M?表型[17,19-20]。例如,脂肪來源的外泌體中高表達miR-34a,靶向Kruppel樣因子4(KLF4)抑制巨噬細胞向M2極化,促進肥胖誘導的脂肪炎癥[21]。在腎損傷研究中發現,腎小管上皮細胞來源外泌體中miRNA-19b-3p顯著高表達,通過負調控細胞因子信號抑制因子-1(SOCS1),并進一步活化NF-κB,促進巨噬細胞向M1極化,最終導致腎損傷的發生[22]。腸癌細胞來源的外泌體miR-934通過下調PTEN表達和激活PI3K/AKT信號通路誘導M2極化并促進腸癌肝轉移[23]。M1和M2具有截然不同的典型表型和功能,但微環境發生改變時M?極化也可發生可逆性轉變[24]。通過調節M?極化來改善RA滑膜炎癥,有望成為新的免疫治療目標[25]。因此,分析RA-FLS與OA-FLS來源外泌體中差異表達miRNA,探究在M1/M2極化起到關鍵作用的miRNA分子及其下游信號通路,將是課題組進一步研究重點。

綜上,本研究發現RA關節液中M1和M2型細胞因子高表達,滑膜中外泌體標志物CD9表達增高;RA-FLS外泌體分泌能力明顯強于OA-FLS,并促進M?向M1極化。深入研究RA-FLS外泌體中對M1極化起關鍵作用miRNA及其下游機制,使用藥理學或遺傳學抑制該關鍵miRNA的功能可能是一種有前景的治療RA的方法。