NCF2/p67phox在泛腫瘤中的表達調控及臨床意義研究進展

謝金波,彭 波

(1.皖南醫學院第一附屬醫院(皖南醫學院弋磯山醫院)泌尿外科,安徽 蕪湖 241001; 2.同濟大學附屬第十人民醫院泌尿外科,上海 200072)

活性氧類(reactive oxygen species,ROS)物質是機體常見的有氧代謝副產物,主要包括超氧陰離子、羥基自由基和H2O2等,不僅參與細胞損傷和病原體清除,在細胞和組織中也作為信號分子激活細胞內特定信號通路調控生物學過程,同時在腫瘤發生、發展及耐藥等方面還起重要作用[1-2]。還原型煙酰腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinu-cleotide phosphate,NADPH)氧化酶催化細胞內的O2還原為ROS,是細胞內源性ROS的主要來源[3-4]。近年來,多項研究報道NCF2/p67phox作為NADPH氧化酶復合物的活化亞基,通過NADPH氧化酶/ROS通路,參與腫瘤發生、發展。本文全面梳理近幾十年來NCF2/p67phox在腫瘤中的研究進展,為后續研究提供參考。

1 NCF2/p67phox基本信息

嗜中性粒細胞胞質因子2(neutrophil cytosolic factor 2,NCF2)又名NOXA2(NADPH oxidase activator 2)和p67phox,是一種典型的無糖基化修飾的細胞質蛋白,相對分子質量為67 000,由526個氨基酸殘基構成,其中包含氨基端肽重復序列結構域(tetratricopeptide repeat,TPP)、高度保守的活化域(activation domain,DA),次保守的PB1(phox and bem 1)結構域和羧基端Src同源結構域3(Src homology 3,SH3)等4個特征性結構域[2],其三維構象見圖1。人類NCF2/p67phox編碼基因位于染色體1q25,長度為34 845 bp,尚未見報道該基因存在任何剪切變異體[2]。有學者在對102個不同種族背景個體的基因組測序信息分析后發現,亞洲人群中的NCF2/p67phox表現出以差異化的單倍型結構為特征的多樣性模式[5]。

2 NCF2/p67phox的表達調控

NCF2/p67phox一度被認為只存在于吞噬細胞,近幾十年研究者們陸續發現其在非吞噬細胞也廣泛表達,目前在多種哺乳動物的吞噬細胞[6-7]、B淋巴細胞[8]、腎小球系膜細胞[9]、內皮細胞[10]、神經元[11]、星形膠質細胞[11]和肝臟星狀細胞[12]等正常在體細胞中檢測到NCF2/p67phox表達。Lindsey等[13]發現在吞噬細胞中HoxA10通過招募HDAC結合至NCF2啟動子抑制其轉錄,這種抑制作用既依賴于HDAC活性也受到細胞因子誘導的HoxA10酪氨酸磷酸化水平的調控。在此基礎上Lindsey等[14]提出SHP2突變能協同HoxA10起作用,抑制包括NCF2在內的骨髓特異性基因轉錄,進而阻礙骨髓細胞分化。Li等[15]進一步證實在未分化的骨髓細胞系中NCF2啟動子活性需要骨髓特異性和非骨髓轉錄因子的合作來維持,包括Sp1/Sp3、PU.1、PU.1/HAF1和AP-1,其中AP-1的作用最為關鍵。Kautz等[16]研究發現SHP1蛋白酪氨酸磷酸酶通過減少PU.1、IRF1、ICSBP及CBP等與NCF2基因的相互作用,在未分化的骨髓細胞中抑制NCF2/p67phox表達,且IRF1和ICSBP酪氨酸殘基對NCF2的轉錄相對更重要。2005年,Gauss等[17]在NCF2啟動子區鑒定出一段全新的增強子應答區,該應答區對TNF-α誘導的NCF2/p67phox表達上調至關重要,緊隨其后的一項研究[18]則證實PLAGL2正是通過結合到NCF2啟動子TNF-α應答區調控其轉錄進程。上述對NCF2表達調控的研究主要圍繞啟動子和轉錄調控。研究者們還發現NCF2是經典抑癌基因p53的靶基因,經過該通路能實現p53的促進細胞存活作用,該研究結果一經公布受到多位學者認同[19-21]。

除內源性調控外,研究者們也探索了外源性藥物對NCF2的表達調控作用:Liu等[22]證實在軟骨細胞中蘇拉明上調NOX2/p67phox表達可以促進NADPH氧化酶活化于胞內并產生ROS。ROS帶來氧化應激的增強抑制PTEN作用從而激活PI3K/AKT通路,通過上調下游SOX9/COL2A/ACAN的表達最終維持軟骨細胞表型。此外,NCF2/p67phox對其他分子也具有調控作用,Datta等[23]發現NOX2/p67phox和真核起始因子2(eukaryotic Initia-tion Factor 2,eIF2)的結合能保護eIF2免于被下游激酶磷酸化,而eIF2是翻譯起始的必需蛋白之一。

3 NCF2/p67phox是NADPH氧化酶關鍵活化亞基之一

目前證實NADPH氧化酶的核心催化亞基gp91phox/NOX2至少還有6種同源物(NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2),被稱為NOX蛋白家族[24]。以NOX2為催化核心的NADPH氧化酶最早被關注,研究較為深入。通常認為由胞膜上的NOX2/gp91phox和p22phox形成的異源二聚體是NADPH氧化酶催化亞基,但NADPH氧化酶要發揮生物催化作用,還需來自細胞質中的多個調節亞基配合。巨噬細胞中NADPH氧化酶復合物示意圖見圖2,其中NCF2/p67phox是NADPH氧化酶的兩個重要活化亞基之一[2,25]。關于NOX2激活事件的一般觀點是p47phox磷酸化導致p47phox-p67phox復合物轉位到細胞質膜,在質膜上p47phox與p22phox相互作用,隨后p67phox通過直接的蛋白間互作對NADPH氧化酶發揮活化作用[26-28]。Tlili等[29]發現NADPH氧化酶復合物一旦組裝完成,NCF2/p67phox在該復合物中穩定存在并持續發揮作用。更有研究證實NCF2/p67phox結合到細胞指定位置和NADPH氧化酶獲得生物活性都離不開p67phox羧基端的SH3結構域[28]。

圖2 巨噬細胞中NADPH氧化酶復合物示意圖

4 NCF2/p67phox通過NADPH氧化酶參與腫瘤多種生物學行為調控

NADPH氧化酶及其調節亞基在多種類型、不同惡性階段的腫瘤細胞中表達異常,提示NADPH參與腫瘤發生及進展的多個環節[30-32]。

4.1 腫瘤發生

ROS在DNA損傷中的作用已受到廣泛認同。報道稱細胞暴露于慢性氧化應激可引起基因組不穩定[33-34],且有證據顯示上述不穩定的基因克隆體中ROS水平明顯增加[35-36]。盡管NADPH氧化酶在上述過程中的確切作用不清楚,一些研究結果還是極具啟發性。Gregg等[37]發現NADPH氧化酶NOX蛋白家族中的NOX4在伴有VHL缺陷的人腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)發生中至關重要,且利用基因技術沉默NOX4能減少RCC細胞內ROS產生,防止HIF-2α在細胞核內積累以及自然插入VHL。上述NOX4沉默的效果能用超氧化物清除劑、TEMPOL、MnSOD或氫氧化酶模擬實現,表明ROS是NOX4調節HIF-2α的關鍵介質。Shimizu等[38]發現人食管鱗狀細胞癌細胞中的NOX2通過B細胞易位基因2(B-cell translocation gene 2,BTG2)相關信號通路影響腫瘤發生。另一項有關NOX2的研究發現夾竹桃麻素(Apocynin)作為NADPH氧化酶抑制劑,通過凝集素和MEK-ERK1/2通路調控細胞增殖,可減少TRAP大鼠模型中的ROS產生同時抑制前列腺癌發生[39]。相信隨著研究的深入,NADPH氧化酶/ROS在更多腫瘤發生中的作用將被揭示。

4.2 腫瘤血管新生

血管生成(angiogenesis)是指從已有的血管形成新的血管,參與各項生理過程如胚胎發育和傷口修復,以及病理過程如缺血性心肌病、腫瘤、糖尿病性視網膜病變或者包括動脈粥樣硬化在內的慢性炎癥等[40]。多項證據顯示胞內NADPH氧化酶催化產生的ROS通過VEGF信號通路對腫瘤血管生成起重要作用。Arbiser等[41]證實NOX1誘導的H2O2增加VEGF及其受體表達,增強基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)活性,進而促進腫瘤血管再生和腫瘤進展。一項膀胱癌的研究[42]發現ALKBH3通過NOX2-ROS和Tweak/Fn14/VEGF信號影響血管再生和腫瘤侵襲。另有兩項研究[43-44]表明,由rac1依賴的NADPH氧化酶催化產生的ROS參與了血管內皮生長因子(VEGF)和血管緊張素-1(Ang-1)介導的內皮遷移。

4.3 腫瘤侵襲轉移

目前尚未發現依賴于NADPH氧化酶的ROS生成與上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、腫瘤細胞侵襲、遷移直接相關,但其參與了細胞骨架重塑、外滲、腫瘤轉移等相關基因的調控[45]。例如激活NADPH氧化酶和產生ROS是誘導二聚糖基因(參與細胞黏附和遷移)和TGF-β誘導的細胞骨架重排所必需[46-47]。另外,血管黏附分子1(VCAM-1)可能誘導NADPH氧化酶依賴的ROS生成,激活內皮細胞的MMP,使得淋巴細胞外滲[48]。值得注意的是,Rac GTPase是細胞侵襲和遷移的重要介質之一[49],也是NADPH氧化酶依賴的ROS生成的上游信號酶[50]。Van der Weyden等[51]的一項動物實驗似乎間接支持NOX2影響腫瘤轉移過程,因為使用基因編輯技術剔除對NOX2發揮催化功能所必需的任何亞基后的小鼠,接受靜脈注射腫瘤細胞后顯示腫瘤肺轉移灶減少。更早的一項研究[52]也證實Cybb-/-小鼠在切除黑色素瘤原發灶后,腫瘤血行轉移發生率顯著降低。無論如何,NADPH氧化酶對腫瘤侵襲轉移影響還有待于進一步驗證。

5 NCF2/p67phox在泛腫瘤的臨床預后作用

NCF2/p67phox作為NADPH氧化酶的活化亞基,對腫瘤生物學表型和臨床預后的作用,來自分子生物學、腫瘤免疫學和臨床醫學等領域的研究者們都在不斷探索,關注的范圍涵蓋實體腫瘤和起源于血液系統的非實體腫瘤,筆者利用“cancer”“tumor”和“carcinoma”等聯合“NCF2”“p67phox”和“NOXA2”等關鍵詞,檢索并復習相關文獻后,對NCF2/p67phox在泛腫瘤中的特征和臨床預后作用研究進展總結見表1。

表1 NCF2/p67phox在泛腫瘤中的表達特征及作用

5.1 泌尿及男性生殖系統腫瘤

相比其他泌尿生殖系統腫瘤,NCF2/p67phox在RCC的作用研究較為深入。Chalbatani等[53]基于GEO數據庫,從環狀RNA入手,利用生物信息分析手段構建RCC中的競爭性內源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)調控網絡,發現NCF2/p67phox等8個關鍵基因的表達與腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)的免疫浸潤和患者生存正相關。類似地,來自國內的一個研究團隊也發現NCF1/2/4與ccRCC的免疫浸潤相關,是潛在的臨床預后靶標[54]。另一項來自國內的研究[55]則是結合蛋白組學和磷酸化修飾組學分析大量腎細胞癌臨床樣本,提出腫瘤中NCF2/p67phox磷酸化水平上調是RCC患者潛在預后靶標。Tan等[56]利用檢測大量腎癌和正常腎組織中的炎癥相關性基因表達水平,發現NCF2/p67phox等基因表達上調的患者伴隨更高的死亡風險。

NCF2/p67phox在其他泌尿系腫瘤的研究也有報道。有研究[57]顯示前列腺癌瘤體中趨化因子的表達和NCF2/p67phox等相關,而趨化因子可以誘導CD8+效應T細胞在癌組織聚集,通常認為CD8+T細胞是機體消滅腫瘤細胞的“天生武器”,這種特征是否具有特殊的生物學意義暫時還不得而知。Huang等[58]研究發現PI3K/AKT信號介導TGIF誘導NOX2/p67phox活化,細胞內ROS含量增加,激活PI3K/AKT信號促進尿路上皮癌的侵襲遷移。睪丸癌相關的一項研究顯示以鉑類為基礎的睪丸癌化療患者伴隨NCF2等關鍵基因的DNA甲基化修飾水平變化,但這種表觀遺傳改變的意義還有待深入討論[59]。

5.2 其他實體瘤

Tian等[60]發現外周血白細胞中包括NCF2在內的5種免疫相關基因的DNA甲基化修飾水平與乳腺癌發病風險相關。另一項在韓國女性中的研究利用大樣本做了與乳腺癌發病風險相關的基因多態性分析,發現NCF2基因多態性與乳腺癌發病風險相關性并不顯著[61]。Lomnytska等[62]觀察宮頸鱗狀細胞癌從上皮內瘤變演變為侵襲性腫瘤的動態過程中NCF2等基因表達的變化,提出NCF2等基因可作為宮頸鱗癌診斷和預后生物標志物。Fletcher等[63]檢測子宮正常肌層和子宮肌瘤瘤體中的NCF2/p67phox等表達后,發現NCF2/p67phox在子宮肌瘤中表達上調,對子宮肌瘤具有潛在的臨床診斷價值。一項研究聯合分析GEO和TCGA數據庫后發現包括NCF2在內的10個基因可介導惡性膠質瘤的放療耐受,可能成為惡性膠質瘤患者放療相應人群的篩選標志物[64]。Ji等[65-66]連續發表2項研究,從不同角度建立以NCF2等為風險因子的預測模型,比較后發現該模型對惡性膠質瘤的預后預測效果優于傳統利用分子病理指標構建的模型,是潛在的放療效果預測工具。Chen等[67]在全面分析惡性黑色素瘤樣本中突變基因表達譜和患者臨床病理特征關系后,提出NCF2等8種基因突變可作為免疫檢查點阻斷治療有效性的預測指標,為惡性黑色素免疫治療提供了篩選適應人群的新方法。Huang等[68]在關于肝細胞癌的研究中發現NCF2/p67phox表達上調伴隨更多的M2型巨噬細胞浸潤和預后不良。另一項研究[69]則是分析肝細胞癌相關的基因共表達網絡后構建出NCF2等12個風險基因組成的肝癌診斷及預后預測模型。Osama等[70]發現包括NCF2在內的5種基因過表達對結腸癌具有潛在診斷價值。Yang等[71]發現MHC-I相關的NCF2等基因單核苷酸多態性可以作為非小細胞肺癌的生存預測標志物。Ma等[72]發現姜黃素在舌癌中的作用是通過NCF2等節點基因傳遞信號,最終抑制舌癌細胞的增殖、遷移。

5.3 血液系統腫瘤

一項急性粒細胞白血病相關的研究顯示NADPH氧化酶的各亞基表達上調是急性粒細胞白血病化療效果的評價標志物[73]。Kikuchi等[74]發現姜黃素在淋巴瘤患者的使用可以上調NCF2/p67phox等表達,代表患者免疫水平增強,可能是判斷治療是否起效的標志物。

6 展 望

NCF2/p67phox不僅在人體多種正常細胞中廣泛表達,在泌尿生殖系統、消化系統、血液系統及其他多種腫瘤組織存在基因多態性、異常表達或者NDA甲基化修飾改變等,見表1。目前對NCF2/p67phox調控機制的大多集中于轉錄調控水平,隨著表觀遺傳學理論的完善和相關技術進步,從轉錄后和蛋白修飾水平研究NCF2/p67phox的調控機制將有助于更完整解釋其在不同細胞或腫瘤組織的表達特異性。

通過文獻復習,本文總結NCF2/p67phox在各種腫瘤中以“促癌”作用為主,目前大多數研究關注NCF2/p67phox表達與臨床預后的關系,NCF2/p67phox“促癌”效應的分子機制研究不夠深入。NADPH氧化酶及其催化產生的胞內ROS在腫瘤中的作用長期以來是研究者們的關注焦點,但胞內ROS作為信號分子參與腫瘤生物學調控的機制仍有待闡明。作為NADPH氧化酶復合物中活化亞基,NCF2/p67phox對NADPH氧化酶發揮催化功能至關重要,但NCF2/p67phox在腫瘤中通過觸發NADPH氧化酶/ROS通路發揮間接調控作用以外,是否其他更直接的分子調控機制,需要更多的研究來證實?？傊?對NCF2/p67phox的深入研究,極可能為腫瘤生物學機制研究提供新思路。