抗人IL-17C單克隆抗體的制備和功能鑒定

劉 麗,張光遠,張芳菲,王依凡,尹建永,汪年松,王 鋒

(1.上海交通大學醫學院附屬第六人民醫院腎內科,上海 200233; 2.東南大學附屬中大醫院泌尿外科,南京 210009)

IL-17細胞因子家族由6個成員組成,包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(也稱為IL-25)和IL-17F。它們通過與受體結合發揮生物學效應,已經發現的IL-17受體包括IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE。IL-17受體家族的特征性結構是受體位于細胞質尾部的稱之為“SEF/IL-17R(SEFIR)”的保守區域[1],SEF/IL-17受體(SEF/IL-17R,SEFIR)與Toll/IL-1受體(Toll-IL-1 receptor,TIR)結構域相似,都屬于STIR(SEFIR and TIR)-結構域超家族[2]。IL-17C與IL-17A的受體有共同的IL-17RA鏈,生物學功能也相似,而與IL-17A明顯不同之處是,IL-17C主要是上皮細胞源性的細胞因子[3]。IL-17RE是IL-17C的特異性受體,在上皮細胞和Th17細胞中高度誘導表達,并與IL-17RA形成異二聚體受體復合物,進而通過NF-κB和MAPK等途徑傳遞信號[4-5]。IL-17C可通過自分泌或旁分泌方式與該IL-17RA/IL-17RE復合物結合,引起炎癥反應,促進促炎癥細胞因子、趨化因子和抗菌肽的釋放[3,6]。IL-17C通過與膜表面受體IL-17RE結合,促進Th17細胞活化。Th17細胞活化一方面可激活適應性免疫系統,增強機體抵御感染的能力而起到免疫保護作用;另一方面其過度活化可導致炎癥放大而致病。已有研究表明,多種自身免疫性疾病與Th17細胞的過度活化有關[7-8]。

在過去的20年中,IL-17C在人類疾病的動物模型和人的標本中得到了廣泛的研究。在許多疾病中,從感染性疾病到自身免疫性疾病,甚至是腫瘤性疾病,都觀察到IL-17C水平增加[9-12]。IL-17C不僅在機體抵御感染方面發揮保護作用,還起致病作用,導致不受控制的炎癥,而用中和抗體抑制IL-17C顯示出保護效應[13]。盡管已經知道IL-17C與這些疾病的發病機制有關,但目前,可用的商品化的人IL-17C單克隆抗體還很少,這阻礙了對疾病的進一步研究。因此,開發和制備人IL-17C單克隆抗體對于闡明IL-17C相關疾病的發病機制具有重要意義和價值。

臨床上,針對IL-17A或其受體IL-17RA的抗體類藥物在靶向治療某些自身免疫性疾病中取得了巨大的成功。例如,IL-17A特異性抗體如蘇金單抗已經在中重度斑塊狀銀屑病患者的系統性生物治療中應用了數年[14]。該單抗也被應用于強直性脊柱炎患者的治療,能夠顯著緩解他們的癥狀和體征[15]。司庫奇尤單抗可應用于中、重度斑塊狀銀屑病和關節病型銀屑病。鑒于靶向IL-17A或IL-17RA的抗體在臨床實踐中出色的應用價值,尋找IL-17C特異性抗體,為患者提供更多的治療選擇具有重要意義。MOR106(諾華)是一種IL-17C特異性抗體,能夠選擇性地與人和小鼠IL-17C結合,從而抑制IL-17C與IL-17RE的結合。臨床前研究表明,MOR106可以緩解銀屑病和特應性皮炎實驗動物模型的皮膚炎癥[13]。目前,MOR106已在中重度特應性皮炎患者中完成了Ⅰ期臨床試驗(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT03568071),試驗結果進一步驗證了其治療效果。本課題組最近證實了IL-17C在腎臟缺血/再灌注損傷(IRI)中的致病作用,發現用中和抗體或IL-17RE敲除抑制IL-17C可以改善腎小管損傷、腎臟氧化應激和腎臟炎癥[16]。因此,針對IL-17C的抗體藥物具有良好的治療應用前景。

本研究利用雜交瘤技術成功制備了9株新的抗人IL-17C中和性單克隆抗體。這些新的單抗具有受體阻斷活性明顯和特異性強的特性,可協助為進一步研究IL-17C的生物學功能和相關疾病的發病機制,以及開發針對IL-17C的新型抗體藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞

6周齡雌性BALB/c小鼠,體重(20±2) g,購自中國科學院上海實驗動物中心。動物飼養于SPF級動物房,并按照中國科學院動物護理和使用指南進行照料、飼養和使用。骨髓瘤細胞系SP2/0由中國科學院細胞庫提供。

1.2 試劑與儀器

人IL-17C蛋白、小鼠IL-17C蛋白、人IL-17RE、重組人IL-17A、IL-17B、IL-17E和IL-17F蛋白(購自百普賽斯,中國);重組HA1乳液;PBS緩沖液;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT培養基、四甲基聯苯胺(TMB)、小鼠抗體亞型分型試劑盒(重鏈)(Sigma,美國);胎牛血清(Hyclone,美國);辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG抗體(Biolegend,美國);RPMI 1640培養基(Gibco,美國);小鼠抗體亞型分型試劑盒(輕鏈)(博奧龍,中國);體外雜交瘤細胞培養基、微孔板讀數儀、二氧化碳培養箱、液氮罐、高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific,美國);Protein G層析柱(Cytiva,美國);重組人IL-17D蛋白(Abcam,英國);37 ℃培養箱(上海一恒科學儀器有限公司,中國);超低溫冰箱(Panasonic,日本);移液槍(Eppendorf,德國);蛋白電泳儀(天能,中國);烘箱(博迅,中國);顯微鏡(奧林巴斯有限公司,中國)。

1.3 用于免疫和功能分析的抗原

本研究利用AcroBiosystems公司提供的人IL-17C蛋白作為免疫原免疫小鼠。該蛋白表達于HEK293細胞,含有組氨酸標簽ILC-H52H7。該蛋白質含有AA His19-Val197(Accession #Q9P0M4-1),SDS-PAGE凝膠電泳測定其純度高于95%,并保留了IL-17C的天然構象,因此,是制備中和IL-17C單克隆抗體的理想抗原。利用AcroBiosystems公司提供的小鼠IL-17C蛋白作為交叉反應檢測的抗原。該蛋白含有AA Asp 17-Gln 194(Accession #Q8K4C5-1),由HEK293細胞表達,并含有組氨酸標簽ILC-M52H7。為了測定所制備的單克隆抗體是否能夠阻斷IL-17C與其受體的結合,采用人IL-17C的特異性受體人IL-17RE對其進行功能分析。該蛋白表達于HEK293,含有AA Thr155-His454。

1.4 單克隆抗體的制備和功能鑒定

1.4.1 動物免疫 取4只6周齡雌性BALB/c小鼠,編號分別為1,2,3和4,以人IL-17C蛋白作為免疫原免疫小鼠,免疫方案所示見表1。

表1 小鼠免疫方案

1.4.2 細胞融合 加強免疫3 d后,收獲小鼠脾細胞并使用50% PEG(W/V)與骨髓瘤細胞系SP2/0(中國科學院細胞庫)融合,并分布在96孔板中。

1.4.3 陽性雜交瘤細胞的篩選 細胞融合后第10 d,使用ELISA法篩選每個孔培養物上清液對IL-17C蛋白的抗體反應性。

1.4.4 陽性雜交瘤細胞的擴增和克隆化培養 利用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行克隆化培養。3個周期后,建立了雜交瘤克隆。其中,確定為陽性克隆的孔,將這一孔的細胞擴增和凍存。

1.4.5 單克隆抗體的大規模制備 將雜交瘤細胞置于PFHM-Ⅱ無蛋白培養基中培養。在體外培養過程中,雜交瘤細胞可分泌抗人IL-17C單克隆抗體,收集培養上清液,離心去除細胞及其碎片,最終獲得所需要的單克隆抗體。

1.4.6 單克隆抗體的效價檢測 競爭ELISA法篩選具有受體阻斷活性的雜交瘤克隆。

1.4.7 單克隆抗體的純度鑒定 使用Protein G層析柱對單克隆抗體進行純化,并對純化后的單抗進行SDS-PAGE凝膠電泳,分析所純化抗體蛋白的純度。

1.4.8 單克隆抗體的交叉反應性測定 利用競爭ELISA法測定單克隆抗體是否與小鼠IL-17C發生交叉反應。

1.4.9 單克隆抗體的特異性鑒定 取人重組IL-17C蛋白抗原適量以及等量人重組IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F蛋白,再分別取濃度為1.5 mg/mL的hIL-17C-7F10和hIL-17C-10A7作為一抗,用PBS將單抗稀釋成濃度為1.000 μg/mL,山羊抗小鼠IgG-HRP為二抗(稀釋比例為1∶2 000),利用ELISA法檢測單抗是否特異性識別人IL-17C。

1.4.10 單克隆抗體的亞型鑒定 按照小鼠抗體亞型分型試劑盒說明書鑒定單克隆抗體重鏈和輕鏈的亞型。

1.4.11 抗人IL-17C單抗7F10的免疫熒光鑒定 以抗人IL-17C單抗7F10為一抗(1∶100稀釋),山羊抗小鼠IgG-HRP為二抗(1∶500稀釋),利用免疫熒光檢測IL-17C在人腎組織的表達與分布。

1.4.12 抗人IL-17C單抗7F10的免疫組化鑒定 以抗人IL-17C單抗7F10為一抗(1∶250稀釋),山羊抗小鼠IgG-HRP為二抗(1∶1 000稀釋),利用免疫組織化學法檢測IL-17C在人腎組織的表達與分布。

2 結 果

2.1 第3次免疫后小鼠抗血清效價ELISA檢測結果

小鼠第2次免疫后,眼球采血并分離血清,利用ELISA法檢測小鼠血清抗hIL-17C抗體的效價,結果見表2。以陽性血清與陰性血清之比(P/N)≥2.1時為陽性的判斷標準,小鼠1血清抗體高于1∶40 500;小鼠2血清抗體效價高于1∶4 500,小鼠3血清抗體效價高于1∶121 500;小鼠4血清抗體效價高于1∶364 500。根據結果可知其中編號為1,3和4的小鼠抗血清效價較高,免疫效果較好,可用于進一步的細胞融合。

表2 第3次免疫后小鼠血清抗體效價ELISA檢測結果

2.2 ELISA法篩選具有人IL-17C受體阻斷活性的抗體

細胞融合后,使用ELISA法建立了與人IL-17C蛋白強烈反應的雜交瘤克隆。進一步用競爭ELISA法篩選具有受體阻斷活性的雜交瘤克隆。將細胞培養上清液與500 ng/mL hIL-17RE預孵育,如果待測抗體具有受體阻斷作用,IL-17RE與包被抗原IL-17C的結合將顯著降低。最終,篩選出9株表現出顯著的受體阻斷活性的雜交瘤克隆,見圖1。

圖1 單克隆抗體受體阻斷活性測定結果

2.3 單克隆抗體的純度鑒定

經Protein G親和層析純化后,對純化的單克隆抗體進行SDS-PAGE凝膠電泳?？捎^察到純化后的抗體純度很高,在相對分子質量約52 000和25 000處分別可見重鏈、輕鏈2個條帶,見圖2。

圖2 純化后抗體SDS-PAGE分析

2.4 交叉反應性鑒定

人和小鼠IL-17C的氨基酸序列相似性為83%,因此對得到的單克隆抗體能否與小鼠IL-17C發生交叉反應進一步測定。將單克隆抗體細胞培養上清液與1 μg/mL mIL-17C預孵育1 h以及不與任何蛋白孵育,利用競爭ELISA法測定其交叉反應性。結果表明,克隆7F10和10A7可與人和小鼠IL-17C發生交叉反應,見圖3。

2.5 單克隆抗體7F10和10A7的特異性鑒定

分別利用抗人IL-17C單抗7F10和10A7為一抗,山羊抗小鼠IgG-HRP為二抗,取人重組IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F蛋白抗原適量,進行ELISA檢測。結果表明,hIL-17C-7F10和hIL-17C-10A7均選擇性結合人IL-17C,而未觀察到與人IL-17A、IL-17B、IL-17D、IL-17E或IL-17F發生交叉反應,見圖4。

圖4 單克隆抗體7F10和10A7選擇性結合人IL-17C

2.6 單克隆抗體7F10和10A7的亞型鑒定

采用抗體亞型分型試劑盒進行鑒定,結果顯示,單克隆抗體7F10和10A7均屬于IgG1亞類,輕鏈為κ型,見圖5。

圖5 單克隆抗體7F10和10A7亞型鑒定

2.7 抗人IL-17C單抗7F10的免疫熒光鑒定

以抗人IL-17C單抗7F10為一抗,利用免疫熒光技術,成功檢測到IL-17C在正常人腎組織的表達。IL-17C主要表達在腎小管[16]。免疫熒光結果顯示,抗人IL-17C單抗7F10可與腎小管組織發生反應,產生特異性的紅色熒光,而腎小球中未見特異性紅色熒光,見圖6。

圖6 單克隆抗體7F10的免疫熒光鑒定

2.8 抗人IL-17C單抗7F10的免疫組化鑒定

以抗人IL-17C單抗7F10為一抗,利用免疫組織化學技術,成功檢測到IL-17C在正常人腎組織的表達。IL-17C主要表達在腎小管[16]。免疫組化結果亦顯示,人正常腎組織腎小管表達IL-17C,而腎小球不表達IL-17C,見圖7。

3 討 論

過去對于IL-17細胞因子家族的研究集中在IL-17A,將其作為自身免疫性疾病的重要分子之一。近年來,越來越多的證據顯示,IL-17C參與了宿主黏膜抗感染防御反應和多種自身免疫性疾病的發病機制。Krohn等[8]首次報道了IL-17C在免疫介導的腎小球疾病中的致病作用;WANG等[16]最近進一步證實了IL-17C在缺血性急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)中的致病作用,這引起了人們對IL-17C在腎臟疾病中潛在參與的高度關注。盡管IL-17C在黏膜抗感染免疫反應中起著保護作用,但其在炎癥刺激下在不同上皮組織中更經常發揮著致病作用。然而,IL-17C如何參與自身免疫性疾病和腎臟疾病的發病機制還未闡明?？赡艿闹虏C制如下:(1) IL-17C在炎癥反應中發揮炎癥放大器作用。IL-17C能夠促進促炎癥細胞因子和趨化因子的表達以及中性粒細胞的募集[11,16]。(2) IL-17C促進Th17細胞應答。Th17細胞以分泌IL-17A、IL-17F為主要特征,它還能分泌產生IL-10、IL-21、IL-22、IL-6和TNF-α等細胞因子,參與了多種炎癥性和自身免疫性疾病的病理過程[17]。(3) IL-17C增強了IL-2的表達以促進NK細胞的活化。根據Huang等[7]的研究,在自身免疫性肝炎模型中,在Con A的刺激下,肝細胞產生的IL-17C與其在肝臟駐留T細胞中表達的受體IL-17RE結合,促進T細胞分泌IL-2,進一步激活NK細胞,引起肝臟損傷。在所研究的潛在信號通路中,用具有受體阻斷活性的中和性單克隆抗體進行干擾,將有助于進一步探索IL-17C的生物學功能和闡明相關疾病的發病機制。

最近研究表明,與IL-17A和IL-17F相比,IL-17C在疾病早期即上調[18]。根據一項關于COVID-19的最新前瞻性研究,IL-17C在早期就被上調,無癥狀參與者血清中IL-17C的水平明顯高于有癥狀的參與者,這表明IL-17C可能保護肺部免受組織損傷和緩解隨后的臨床癥狀[19]。在多種自身免疫性疾病,如銀屑病、特應性皮炎和實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)中觀察到IL-17C的水平升高[13,20]。對中度至重度銀屑病患者的血漿蛋白分析表明,經過系統治療的患者的IL-17C的循環水平低于未治療的患者[21]。因此,可以考慮將循環IL-17C作為一種潛在的生物標志物來評估系統性抗銀屑病治療的效果。在患有腎臟疾病的患者或小鼠模型中也觀察到IL-17C的水平升高。例如,與健康對照組相比,急性抗中性粒細胞胞質抗體(mlli-neutrophil cyto-plasmic antibodies,ANCA)相關的新月形腎小球腎炎患者的血清中IL-17C水平明顯增加,而IL-17A、E或F則沒有[8]。此外,IL-17C在AKI患者和小鼠的腎臟活檢中也明顯增加[16]。由于IL-17C水平在多種疾病中均有不同程度的升高,因此,IL-17C單克隆抗體可用于通過ELISA等免疫學檢測方法來量化IL-17C在疾病中的表達,并結合各種臨床參數為這些疾病的診斷和治療提供新策略。

本研究用HEK293表達的人IL-17C蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠,通過細胞融合和雜交瘤技術,成功篩選出9株可穩定分泌具有顯著的受體阻斷效應的雜交瘤細胞株,分別命名為1F11、3A3、7F10、9B3、10C6、10A7、10B10、12F1和12F7?？贵w的主要藥用價值之一在于是否具有受體阻斷活性[22]。篩選出既能識別人又能識別小鼠IL-17C的單克隆抗體可直接在小鼠模型中完成藥效實驗,有利于將來治療性單抗的進一步開發,否則要用轉人IL-17C的轉基因小鼠做藥效實驗,開發難度將大很多。因此,本研究利用競爭ELISA法鑒定制備的單抗是否既能識別人又能識別小鼠IL-17C,結果表明,單抗7F10和單抗10A7可以引起人和小鼠IL-17C之間的交叉反應。亞型鑒定結果顯示二者均為IgG1亞類,輕鏈為κ型。但是,此技術生產的是鼠源性的單克隆抗體,用于人身上會產生強烈的免疫反應。因此,未來的研究需要通過人源化對單克隆抗體進行進一步改造,以滿足醫療需求。目前,已有多種抗體人源化改造策略,可以顯著減少潛在的免疫原性風險,而幾乎不改變其對抗原的高親和力和強特異性,生物活性也較少改變[23]。這些方式改造的人源化單克隆抗體有助于從基礎成功轉化到臨床。如能成功進行人源化改造,則可能對IL-17C介導的免疫炎癥性疾病具有臨床應用價值。

總之,本研究中抗人IL-17C單克隆抗體的成功制備為進一步開發人源化IL-17C單克隆抗體和新的針對IL-17C的靶向藥物用于IL-17C相關疾病的免疫治療提供了可能。此外,目前檢測IL-17C表達的免疫檢測方法價格昂貴,不能很好地用于臨床,而本研究中制備的單克隆抗體7F10作為一抗可應用于免疫熒光和免疫組化檢測,可能有助于改進用于IL-17C的免疫檢測方法,如Western印跡法檢測、免疫熒光檢測、免疫組織化學和IL-17C ELISA試劑盒。