COFs材料磁固相萃取-HPLC-MS/MS法測定烘焙食品中兩種主要晚期糖基化終末產物

余晶晶,史莉莉,劉雨欣,陳滿堂,劉瑞紅,劉偉

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院,河南 鄭州 450001;2.河南工業大學 糧油食品學院,河南 鄭州 450001

0 引言

食品中晚期糖基化終末產物(Advanced Glycation Endproducts, AGEs)是美拉德反應的終產物[1-3],根據其來源可分為內源性AGEs和外源性AGEs。外源性AGEs在人體內逐漸累積[4-6]容易誘發機體產生內源性AGEs[7],并與多種疾病的發生密切相關,如糖尿病慢性并發癥、動脈粥樣硬化、老年癡呆癥等[8-16]。羧甲基賴氨酸(Nε-(carboxymethyl)lysine),CML)和羧乙基賴氨酸(Nε-(carboxyethyl)lysine, CEL)是兩種主要的AGEs,常被作為食品中AGEs生成的考查指標[17-19]。烘焙食品一般由高溫烘焙加工而成,富含碳水化合物、脂肪和蛋白質,被認為是膳食中AGEs的重要來源之一[20-21]。高效液相色譜-串聯質譜(High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, HPLC-MS/MS)法因靈敏度和定性準確度較高,是目前分析AGEs較為常用的技術手段[22-26]。然而,由于CML和CEL的極性和水溶性較強,采用反相色譜分離時存在色譜保留效果較差、分離度較低等問題;同時,食品基質非常復雜,盡管使用了同位素內標,HPLC-MS/MS法基質效應仍然較強,定量分析準確性較差,Y.Nomi等[25]的研究結果也證實了該問題的存在?？梢?食品基質中AGEs的準確定量分析是一個具有挑戰性的課題。

磁固相萃取(Magnetic Solid Phase Extraction, MSPE)技術具有操作簡單快速、吸附劑可重復使用等優點。共價有機骨架聚合物(Covalent Organic Frameworks, COFs)材料具有比表面積大、熱穩定性高、密度小等優點?；诖判訡OFs材料的MSPE技術結合了二者的優勢,在復雜樣品基質中痕量化學成分的富集和分析領域得到了廣泛應用[27-29]。為改善CML和CEL的色譜分離效果,同時降低HPLC-MS/MS法的基質效應,本文擬建立一種可準確分析烘焙食品中CML和CEL的新方法,該方法采用9-芴基甲基氯甲酸酯(9-Fluorenylmethyl Chloroformate, FMOC-Cl)對二者進行衍生化反應,然后采用磁性COFs材料((TpTph)@Fe3O4)對二者的9-芴基甲氧羰基(9-Fluorenyl Methoxycarbonyl,FMOC)衍生產物進行MSPE,再結合HPLC-MS/MS法對二者進行定量分析考查,以期為因基質效應造成的AGEs難以準確定量分析的問題提供解決方案。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

烘焙食品樣品,鄭州永輝超市(萬和城店)。

CML、CEL、氘代羧甲基賴氨酸(d4-CML)和氘代羧乙基賴氨酸(d4-CEL)標準品(純度≥99.9%),加拿大Toronto Research Chemicals公司;FMOC-Cl(色譜純,純度≥97.0%),梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;2,4,6-三羥基-1,3,5-苯三甲醛(Tp,純度為95%)、對苯二胺(Pa-1,純度為99.9%),北京伊諾凱科技有限公司;FeCl3·6H2O(ACS級試劑,純度為97%)、1,6-己二胺(純度為98%),美國Sigma-Aldrich公司;乙二醇(分析純),天津科密歐試劑公司;無水乙酸鈉(純度為99%),天津阿法埃莎化學有限公司;無水乙醇(分析純),天津風船化學試劑科技有限公司;乙腈、甲醇、正己烷、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF),均為色譜純,美國Dikama公司;甲酸(色譜純),美國TEDIA公司;HCl、NaOH、H3BO3、NaBH4,均為分析純,國藥化學試劑北京有限公司;氨水(分析純),德國CNW Technologies公司。

1.2 主要儀器與設備

API 4000型質譜儀,美國AB SCIEX公司;1200型高效液相色譜儀,美國Agilent公司;Milli-Q50型超純水儀,美國Millipore公司;CP2245型電子天平(精度為0.000 1 g),德國Sartorius公司;THS-10精密型超級恒溫槽,寧波天恒儀器廠;Turbovap Ⅱ型氮吹濃縮儀,美國Caliper lifesciences公司;Multi Reax型多位試管渦旋振蕩混勻器,德國Heidolph公司;Waters C18型色譜柱(100 mm×2.1 mm×2.7 μm),沃特世科技(上海)有限公司;Tristar Ⅱ3020型全自動比表面積和孔隙分析儀,美國麥克儀器公司;TENSOR 27型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀,德國BRUKER公司;TECNAI G2 F20型高分辨透射電鏡(HTEM),美國FEI公司;PPMS-9型綜合物性測量系統,美國Quantum Design公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 磁性COFs材料合成參考文獻[30],采用水熱反應法制備氨基功能化磁性Fe3O4納米顆粒(Fe3O4-NH2)。稱取4.0 g FeCl3·6H2O至500 mL三口燒瓶中,加入120 mL乙二醇,置于50 ℃水浴中機械攪拌使其溶解;依次加入8.0 g無水乙酸鈉和26.0 g 1,6-己二胺,繼續機械攪拌0.5 h得均一溶液;將溶液轉移至200 ℃水熱反應釜中反應6 h后,將液體全部轉移至燒杯中,利用磁鐵分離,棄去上層溶液,分別用去離子水和95%(若無特指,百分數均指體積分數,下同)的乙醇溶液洗滌 Fe3O4-NH23～5次(體積均約50 mL);所得Fe3O4-NH2置于通風櫥約4～8 h后,置于50 ℃真空干燥箱中干燥12 h,得到干燥的Fe3O4-NH2,備用。

參考文獻[31-32]報道的合成方法,以Tp為固定單體,與單體Tph,通過Sciff-Base作用合成COFs。在合成過程中加入Fe3O4-NH2粒子,其氨基與Tp上的醛基發生Sciff-Base作用,從而合成磁性COFs材料(見圖1),合成步驟如下:稱取0.063 0 g Tp于250 mL三口燒瓶中,加入10 mL無水乙醇,超聲溶解;加入0.105 0 g Fe3O4-NH2,超聲振蕩10 min后,置于50 ℃水浴中機械攪拌30 min;另稱取0.117 1 g Tph于小燒杯中,加入10 mL無水乙醇使其溶解,常溫機械攪拌下將其緩慢逐滴加入上述混合溶液中,繼續攪拌12 h;將溶液置于45 ℃旋轉蒸發儀中蒸干,依次采用DMF、95%的乙醇溶液、甲醇洗滌;置于50 ℃真空干燥箱中干燥12 h,即得磁性COFs材料((TpTph)@Fe3O4)。

圖1 磁性COFs材料的合成示意圖Fig.1 Synthesis scheme of magnetic COFs materials

1.3.2 磁性材料表征采用全自動比表面積和孔隙分析儀檢測材料比表面積和孔結構:材料經100 ℃預干燥16 h;氮氣吸附-脫附實驗選擇meso-micro模板進行。

采用溴化鉀壓片法,利用傅里葉變換紅外光譜儀表征材料的官能團。

采用HTEM表征材料表面形貌,加速電壓300 kV,無水乙醇分散,超聲10 min,普通銅網制樣。

采用綜合物性測量系統檢測材料磁性,室溫條件,磁場范圍±2T。

1.3.3 樣品前處理1)衍生化反應。準確稱取40 mg研磨粉碎的烘焙樣品,使用5 mL正己烷脫脂3次,N2吹干;加入1.5 mL硼酸鈉溶液(0.2 mol/L,pH值為9.2),然后緩慢加入1 mL 0.1 mol/L的硼氫化鈉溶液,置于4 ℃冰箱中還原12 h;將反應液倒入水解管中,加入2.6 mL 12 mol/L濃HCl溶液,于N2保護下110 ℃水解反應24 h,過濾,用KOH溶液(10 mol/L)調節反應液pH值為8.0～9.0,超純水定容至10 mL,得到樣品酸解溶液。取1 mL樣品酸解溶液加入100 μL內標溶液(d4-CML和d4-CEL的質量濃度均為1.0 μg/mL),混勻;取上述溶液500 μL,加入500 μL乙腈,混勻后加入200 μL硼酸鹽緩沖溶液(pH值為 9.0)和200 μL的FMOC-Cl(質量濃度為15 g/L)乙腈溶液,渦旋混勻,于40 ℃水浴反應10 min,冷卻至室溫后,加入5 μL甲酸終止反應,再用50%的乙腈溶液稀釋至3 mL,得到樣品衍生化溶液[33]。

2)MSPE方法。在樣品衍生化溶液中加入20 mg磁性COFs材料,渦旋萃取20 min,利用磁鐵實現相分離,棄去溶液;分別使用5 mL超純水和二氯甲烷對磁性材料進行洗滌;加入4 mL 5%的氨水/甲醇溶液,渦旋萃取洗脫15 min,洗脫液經N2吹干,用1 mL 超純水復溶后,進行HPLC-MS/MS分析。

1.3.4MSPE條件優化分別對吸附劑用量(10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg)、渦旋萃取時間(5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min)、洗脫溶劑種類(甲醇、1%氨水/甲醇、5%氨水/甲醇、10%氨水/甲醇)、洗脫溶劑體積(2 mL、4 mL、5 mL、6 mL)和洗脫時間(5 min、10 min、15 min、20 min、30 min)進行優化。當優化其中一個因素時,其他因素均設定為最優。

1.3.5 磁性COFs材料循環實驗依次利用DMF、95%的乙醇溶液、甲醇對使用過的磁性COFs材料((TpTph)@Fe3O4)進行洗滌,置于50 ℃真空環境中干燥12 h后,再次進行MSPE,考查磁性材料的循環使用效果。

1.3.6 本文方法表征1)標準工作曲線繪制。將CML和CEL標準品配制成質量濃度均為10 μg/mL的混合標準溶液,將d4-CML和d4-CEL標準品配制成質量濃度均為1 μg/mL的混合內標溶液;準確移取混合標準溶液50 μL、100 μL、200 μL、400 μL、800 μL,分別加入1 mL混合內標溶液,用超純水定容至10 mL,得到系列標準工作溶液;按照1.3.3中的方法進行衍生化處理后,進行HPLC-MS/MS分析,采用內標法繪制標準曲線。

2)基質效應考查。選擇烘焙食品樣品中的餅干和堅果為典型基質,按照1.3.3進行樣品前處理,并加入系列標準工作溶液,配制基質標準工作溶液,進行HPLC-MS/MS分析,采用內標法繪制標準曲線。

3)加標回收實驗。分別以餅干和堅果為典型基質,在低、中、高3個水平下進行加標回收實驗。

4)日內、日間精密度(RSD)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)測定。日內精密度為同一天測定,平行測定5次;日間精密度為不同天測定,平行測定5次;取最低質量濃度標準工作溶液,采用HPLC-MS/MS法平行測定10次,計算標準差(SD),3倍SD為LOD,10倍SD為LOQ。

1.3.7 測試條件Waters C18型色譜柱;柱溫35 ℃;進樣量10 μL;流速0.3 mL/min。流動相:A相為0.5%甲酸的水溶液,B相為乙腈。梯度洗脫條件:0～5.0 min,50%～41% A;5.1～9.0 min,41%～5% A;9.1～11.0 min,5%～50% A。

離子源為電噴霧離子源(ESI);掃描模式為正離子掃描;檢測方式為多反應監測(MRM);電噴霧電壓5500 V;氣簾氣壓力206.85 kPa;輔助氣1壓力482.65 kPa;輔助氣2壓力482.65 kPa;離子源溫度500 ℃;駐留時間50 ms;各化合物的定量離子對、定性離子對、駐留時間、碰撞能量(CE)及去簇電壓(DP)見表1。

表1 CML-FMOC、CEL-FMOC及其內標溶液的MRM參數Table 1 Specic parameters of CML-FMOC, CEL-FMOC and internal standards for MRM analysis

表1 CML-FMOC、CEL-FMOC及其內標溶液的MRM參數Table 1 Specic parameters of CML-FMOC, CEL-FMOC and internal standards for MRM analysis

化合物定量離子對(m/z)定性離子對(m/z)駐留時間/msCE/VDP/VCML-FMOC649.4/427.2649.4/179.55019100CEL-FMOC663.3/441.5663.3/179.55020100d4-CML-FMOC653.4/431.2653.4/179.55019100d4-CEL-FMOC667.3/445.5667.3/179.55020100

1.4 數據處理

每組進行3次重復實驗,數據均以(平均值±標準差)表示;采用Analyst?1.6 Software進行AGEs數據分析;使用Origin 2021制圖。

2 結果與分析

2.1 磁性COFs材料表征結果分析

2.1.1 比表面積和孔結構采用全自動比表面積和孔隙分析儀對所合成的磁性COFs材料進行氮氣-吸附脫附實驗,結果表明,Fe3O4-NH2的比表面積為32.83 m3/g,孔體積為0.15 cm3/g,平均孔徑為113 nm;磁性COFs材料((TpTph)@Fe3O4)的比表面積為115.43 m3/g,孔體積為0.63 cm3/g,平均孔徑為3.7 nm。因此,所合成的磁性COFs材料呈多孔結構,且比表面積較大,適合復雜基質中痕量成分的富集分離。

2.1.2 形貌表征圖2為磁性COFs材料的HTEM圖。由圖2可知,Fe3O4-NH2粒徑均勻,平均粒徑約為50 nm;而磁性COFs材料除了有COFs材料包裹在Fe3O4-NH2粒子外,還存在樹枝狀生長的COFs材料,粒徑不均勻。

圖2 磁性COFs材料的 HTEM圖Fig.2 HTEM images of magnetic COFs materials

圖3 磁性COFs材料的FT-IR譜圖Fig.3 FT-IR spectrum of magnetic materials

2.1.4 磁性分析圖4為磁性COFs材料的磁滯回線。由圖4可知,Fe3O4-NH2和磁性COFs材料的飽和磁化強度分別為40.1 emu/g和30.3 emu/g,這可能是COFs聚合物對Fe3O4-NH2粒子的包覆所致。磁性COFs材料保持較高的飽和磁化強度有助于其在外部磁場中快速響應,適用于MSPE技術。

2.2 前處理條件優化結果分析

2.2.1 衍生化反應條件優化結果由于CML和CEL的極性和水溶性均較強,在反相液相色譜柱上出峰較早(3.0 min之前),且二者分離度較差[25]。因此,本文采用FMOC-Cl對CML和CEL進行衍生化反應,降低二者極性,推遲色譜出峰時間。圖5為MRM模式下CML-FMOC和CEL-FMOC及其內標衍生物的HPLC-MS/MS色譜圖。由圖5可知,CML-FMOC和CEL-FMOC的保留時間分別為7.43 min和7.73 min,二者實現了基線分離;氘代內標衍生物同樣實現了基線分離。

圖5 MRM模式下CML-FMOC、CEL-FMOC及其內標衍生物的HPLC-MS/MS色譜圖Fig.5 Chromatograms of CML-FMOC, CEL-FMOC and their internal standards in MRM mode

2.2.2MSPE條件優化結果圖6為不同萃取條件對目標物萃取量的影響。由圖6a)可知,CML和CEL衍生物的萃取量均隨吸附劑用量增大呈先升高后降低再穩定的變化趨勢,當吸附劑用量為20 mg時,CML和CEL衍生物的萃取量均達最大值。因此,選擇20 mg為適宜的吸附劑用量。

圖6 不同萃取條件對目標物萃取量的影響Fig.6 The effect of different extraction conditions on the extraction quantity of target substance

由圖6b)可知,隨著渦旋萃取時間的延長,目標物萃取量均先增加后降低。當渦旋萃取時間為20 min時,CML和CEL衍生物的萃取量均達到最大值。因此,選擇20 min為適宜的漩渦萃取時間。

由圖6c)可知,5%氨水/甲醇的洗脫效果最好。因此,選擇5%氨水/甲醇為適宜的洗脫溶劑。

由圖6d)可知,隨著洗脫溶劑體積增加,目標物萃取量均呈先升高后降低再穩定的變化趨勢,當洗脫溶劑體積為4 mL時,目標物萃取量均達到最大值。因此選擇4 mL為適宜的洗脫溶劑體積。

由圖6e)可知,隨著洗脫時間的延長,目標物萃取量均先升高后降低,當洗脫時間為15 min時,目標物即能被洗脫完全。因此,選擇15 min為適宜的洗脫時間。

綜上可知,本文MSPE的適宜條件如下:吸附劑用量為20 mg,渦旋萃取時間為20 min,洗脫溶劑選用5%氨水/甲醇溶液,洗脫溶劑體積為4 mL,洗脫時間為15 min。

2.3 磁性COFs材料循環使用效果

圖7為磁性COFs材料循環使用效果圖,其中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。由圖7可知,磁性COFs材料再生5次,目標物萃取量仍保持在90%以上;當磁性COFs材料再生第6次時,目標物的萃取量低于90%。因此,本文合成的磁性COFs材料能循環使用5次。

圖7 磁性COFs材料循環使用效果圖Fig.7 Reuse performance of magnetic COFs materials

2.4 分析方法表征

表2為本文方法的標準曲線方程和基質效應,其中斜率比指基質配標線性方程與溶劑配標線性方程的斜率比。由表2可知,斜率比在1.04～1.15之間,低于文獻 [25-26]的結果,表明本文方法能有效地降低基質效應,提高定量分析的準確性。因此,可將溶劑配標的標準工作曲線用于烘焙食品樣品分析。

表2 本文方法的標準曲線方程和基質效應Table 2 Standard curves and matrix effects of the method

表3為本文方法加標回收率、RSD、LOD和LOQ測定結果。由表3可知,餅干基質中CML和CEL的加標回收率分別為90.70%～108.74%和85.50%～105.60%;堅果基質中CML和CEL的加標回收率分別為91.80%～105.40%和92.45%～113.00%;日內和日間精密度均良好(RSD日內≤4.74%,RSD日間≤5.38%)。CML和CEL的LOD分別為2.05 ng/mL和2.31 ng/mL,LOQ分別為6.83 ng/mL和7.71 ng/mL,適用于烘焙食品中的CML和CEL的定量分析。

表3 本文方法加標回收率、RSD、LOD和LOQ測定結果Table 3 Recoveries, precisions, limits of detection and limits of quantification of method

2.5 實際樣品分析

采用本文方法對市售的26種烘焙食品中CML和CEL的含量進行測定,結果見表4。由表4可知,餅干、糕點類烘焙食品中二者含量范圍分別為(9.60±0.16)～(78.10±1.12)mg/kg、(4.37±0.23)～(26.70±1.27)mg/kg;堅果類烘焙食品中二者含量范圍分別為(6.49±0.13)～(82.00±0.98)mg/kg、(6.65±0.30)～(55.90±0.67)mg/kg,與文獻[21-22]報道的結果接近?？梢?不同類型烘焙食品及同類烘焙食品不同品牌之間,CML和CEL的含量均存在明顯差異。另外,烘焙食品中CML和CEL的含量普遍偏高,長期食用存在一定的健康風險。

表4 市售烘焙食品樣品中CML和CEL含量測定結果Table 4 Determination results of CML and CEL content in commercially available baked food samples

3 結論

本文合成了一種磁性COFs材料((TpTph)@Fe3O4),并建立了基于磁性COFs材料的MSPE技術用于烘焙食品樣品中CML和CEL的高效、選擇性富集,并采用HPLC-MS/MS法對CML和CEL進行定量分析,得出如下結論:1)所合成的磁性COFs材料具有較大的比表面積和較高的磁化強度,適合應用于MSPE技術。2)MSPE的適宜條件為:吸附劑用量20 mg,渦旋萃取時間20 min,洗脫溶劑選用5%氨水/甲醇溶液,洗脫溶劑體積4 mL,洗脫時間15 min。3)所合成的磁性COFs材料可再生循環使用5次。4)CML和CEL的LOD分別為2.05 ng/mL、2.31 ng/mL,LOQ分別為6.83 ng/mL、7.71 ng/mL;日內精密度(RSD日內≤4.74%)和日間精密度(RSD日間≤5.38%)良好;在餅干、堅果2種典型樣品基質中,CML和CEL的加標回收率較好,分別為90.70%～108.74%、85.50%～113.00%。5)對于市售的26種烘焙食品,餅干、糕點類中CML和CEL含量范圍分別為(9.60±0.16)～(78.10±1.12) mg/kg、(4.37±0.23)～(26.70±1.27)mg/kg;堅果類中二者含量范圍分別為(6.49±0.13)～(82.00±0.98)mg/kg、(6.65±0.30)～(55.90±0.67)mg/kg。本文所建立的方法能顯著降低基質效應,有效提高樣品定量分析準確性,為復雜食品基質中AGEs定量分析提供了新思路。