新疆維吾爾自治區和田地區規?；驁龈篂a羔羊源大腸桿菌的分離鑒定及毒力基因和耐藥基因分析

董 貴，于月通，馬志遠，王 堯，盛光玉，陶大勇，齊 萌

（1.塔里木大學動物科學與技術學院/新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室， 新疆 阿拉爾843300；2.塔城職業技術學院，新疆 塔城 834700）

大腸桿菌（Escherichia coli）是引起羔羊腹瀉的主要病原菌之一， 可導致腹瀉羔羊50%以上的死亡率，常給羊養殖業造成較大的經濟損失［1］。 根據Clermont 等［2］建立的分群方法，將大腸桿菌分為A 群、B1 群、B2 群和D 群， 不同群組間大腸桿菌攜帶的毒力基因具有一定差異。研究表明，大腸桿菌所攜帶的毒力基因種類與致病性有密切關系，其中腸細胞脫落位點（locus of enterocyteeffacement，LEE） 毒力島、 耶爾森菌強毒力島 （highpathogenicity island，HPI）可編碼多種毒力基因，是致病性大腸桿菌重要的毒力因子［3］； 溶血素（hemolysin，Hlf）可溶解細胞，造成嚴重的細胞毒性，在大腸桿菌致病過程中起到了重要作用［4］。 由于臨床生產中使用抗菌藥物不合理， 導致大腸桿菌的耐藥性不斷增強， 給羊大腸桿菌病的防治帶來較大的挑戰。令人擔憂的是，耐藥的動物源大腸桿菌及其耐藥基因可通過食物鏈、 生產鏈和糞便等途徑傳給人類，危害人類健康［5］。

隨著新疆維吾爾自治區和田地區養羊業的快速規?；l展，圈養羊數量不斷增加，羊腹瀉發生較普遍，對養羊業的健康發展構成較大的威脅。生產中為治療羊腹瀉， 基層養殖人員大量使用抗菌藥物，造成羊源大腸桿菌產生較多耐藥株，其耐藥機制也日趨復雜，呈現多種耐藥現象，潛在影響了羊肉食品質量安全和環境衛生安全［6］。 本試驗旨在分離鑒定和田地區規?；B殖場腹瀉羔羊糞便中的大腸桿菌，檢測其毒力基因和耐藥基因，以期為該地區規?；驁龊侠碛盟?， 預防和治療羔羊腹瀉病提供有益參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 糞便樣本來源

于2019 年1—9 月，分別在和田地區策勒縣、和田縣和于田縣3 個規?；驁鍪占?0 日齡以內腹瀉羔羊肛拭子樣本共70 份，其中策勒縣23份、和田縣30 份和于田縣17 份， 標記信息后置4 ℃冷藏箱，送至實驗室，4 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑

Luria-Bertani（LB）液體培養基、麥康凱瓊脂（MAC）培養基、伊紅美蘭瓊脂（EMB）培養基，奧博星生物技術（北京） 有限責任公司產品；DL 2 000 Marker、2×Easy Taq PCR Super Mix（+dye）、細菌基因組DNA 提取試劑盒，全式金生物技術（北京）有限公司產品；細菌微量生化反應管，濱和微生物試劑（杭州）有限公司產品；革蘭染色液，為筆者所在實驗室自配。

1.2 試驗方法

1.2.1 糞便樣本處理

1.2.2 大腸桿菌的分離及形態學鑒定

取上述增菌液中的菌液分別劃線接種于EMB 固體培養基、MAC 固體培養基，37 ℃恒溫培養18 h，挑選在EMB 平板上呈現金屬光澤的單一菌落和MAC 平板上玫紅色疑似大腸桿菌的單一菌落，進行純化。純化完成后挑選形態良好的單菌落進行革蘭染色， 經普通光學顯微鏡進行細菌形態學觀察和鑒定。

1.2.3 大腸桿菌的生化鑒定

經形態學觀察后，無菌吸取5 μL 增菌液，按照說明書操作， 置入生化管內，37 ℃恒溫培養12 h，培養完成后觀察并記錄生化反應結果， 結果參照《常見細菌系統鑒定手冊》［7］進行生化鑒定。

1.2.4 細菌基因組DNA 提取和PCR 擴增

經形態學和生化鑒定為疑似大腸桿菌的分離菌，按照細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書對分離菌株進行DNA 提取。 參照劉肖利等［8］報道的序列，設計細菌線粒體16S rDNA 通用引物進行PCR擴增， 上游引物序列為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， 下游引物序列為1 492 R：5′-CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3′，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。 PCR 反應體系為25 μL：2×EasyTaq PCR Super Mix（+dye）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，DNA 模板1 μL，陰性對照是將DNA 模板替換成ddH2O。PCR 擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR 擴增結束后，吸取5 μL 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像儀拍照。 將PCR 陽性產物送至蘇州金維智生物科技有限公司進行雙向測序， 測序結果進行BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對分析后鑒定分離細菌的種類。

1.2.5 大腸桿菌系統發育群的鑒定

根據Clermont 等［2］報道設計大腸桿菌系統發育群基因引物序列，引物序列和目的片段見表1。PCR 反應體系為25 μL：2×EasyTaq PCR Super Mix（+dye）12.5 μL， 上、 下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，DNA 模板1 μL。 PCR 反應程序為：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min。

因為人類生活的環境具有相似性，所以在交際過程中存在雙方互明的共知環境，也就是相互認知環境。在電影字幕翻譯中，如果新信息與譯語觀眾過去的知識或經驗是一致的或相關的，那么譯語觀眾就可以理解源語作者的信息意圖。心理學家巴特利特（Bartlett）將“對過去的反應和經驗的積極組織”定義為圖式。[5]因此，在這種情況下，譯者可以通過激活譯語觀眾的相關圖式，從而使他們把握源語作者的信息意圖，獲得足夠的語境效果。我們來看《英倫對決》電影中相關情況的一些例子。

表1 大腸桿菌系統發育群分型鑒定PCR 引物信息

根據電泳結果鑒定大腸桿菌的系統發育群分型，鑒定標準為：同時在chuA 和yjaA 基因位點或同時在chuA、TspE4.C2 和yjaA 基因位點PCR 擴增成功的分離菌屬于B2 群； 僅在chuA 基因位點或同時在chuA 和TspE4.C2 基因位點PCR 擴增成功的分離菌屬于D 群；僅在TspE4.C2 基因位點PCR 擴增成功的分離菌屬于B1 群； 僅在yjaA 基因位點PCR 擴增成功或在3 個位點均PCR 擴增不出條帶的分離菌屬于A 群。

1.2.6 大腸桿菌毒力基因和耐藥基因的PCR 擴增

分 別 參 考 孟 相 秋［9］和 劉 少 昆［10］的 報 道 設 計 大腸桿菌毒力基因和耐藥基因引物， 引物序列和目的片段見表2 和表3。 PCR 反應體系均為25 μL：2×EasyTaq PCR Super Mix （+dye） 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，DNA 模板1 μL。PCR 反應程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（退火溫度見表2 和表3），72 ℃延伸2 min，35 個循環；72 ℃延伸10 min。

表2 大腸桿菌毒力基因PCR 引物信息

表3 大腸桿菌耐藥基因PCR 引物信息

2 結果與分析

2.1 分離菌株的形態學和生化鑒定

經形態學和生化鑒定，從70 份腹瀉羔羊糞便樣本中初步分離大腸桿菌38 株，分離率為54.3%（38/70）。 分離菌在MAC 培養基中呈紅色透明菌落（見圖1）；挑取單個菌落革蘭染色鏡檢，可見分離菌兩端鈍圓形，為紅色短桿狀的陰性菌。分離菌在EMB 培養基中呈金屬光澤的菌落（見圖2）；挑取單個菌落進行革蘭染色鏡檢， 同樣可見分離菌為紅色短桿狀的陰性菌。

圖1 分離菌株在MAC 平板上的菌落形態

圖2 分離菌株在EMB 平板上的菌落形態

對38 株分離菌進行生化鑒定， 結果顯示，分離菌均可發酵鼠李糖、木糖、蕈糖等糖；靛基質、MR 試驗均顯示陽性；尿素、硫化氫和VP 試驗均為陰性，與《常見細菌系統鑒定手冊》中大腸桿菌的生化鑒定結果相符合。

2.2 分離菌株的16S rDNA 序列PCR 擴增、測序及比對

對經形態學和生化鑒定初步鑒定為大腸桿菌的38 個分離菌， 采用PCR 法擴增其16S rDNA 序列。結果表明，38 株疑似大腸桿菌均擴增出1 500 bp左右的目的條帶（見圖3）。 38 份PCR 產物均成功測序，發現本試驗所獲分離菌的16S rDNA 序列與美國加利福尼亞州牛糞便來源大腸桿菌（GenBank登錄號：CP050498） 的16S rDNA 序列同源性為99.3%～100%。 基于分離菌株形態學、生化鑒定和16S rDNA 序列鑒定結果， 可以確定分離的38 株菌均為大腸桿菌。

圖3 分離菌株基于細菌16S rDNA 基因的PCR 擴增結果

2.3 大腸桿菌系統發育群分型鑒定

3 個基因位點的目的片段PCR 擴增結果見圖4。 38 株大腸桿菌分離菌中， 僅在yjaA 基因位點PCR 擴增成功的分離菌共計10 株，鑒定為A 群，所占比例為26.3%（10/38）；僅在TspE4.C2 基因位點PCR 擴增成功的分離菌共計26 株， 鑒定為B1群， 所占比例為68.4%（26/38）； 同時在chuA 和TspE4.C2 基因位點PCR 擴增成功的2 個分離菌，鑒定為D 群，所占比例為5.3%（2/38）；未檢測到B2 群大腸桿菌。

圖4 系統發育群分型3 個基因位點PCR 擴增結果

2.4 大腸桿菌毒力基因的檢測

采用PCR 法檢測38 株大腸桿菌分離菌的8種毒力基因，結果檢測到4 種毒力基因（見表4），其中以攜帶fimC 基因的菌株最多， 所占比例為92.1%（35/38），其余依次為irp2 基因［所占比例為47.4%（18/38）］、hlyF 基因 ［所占比例為36.8%（14/38）］、 fyuA［所占比例為34.2%（13/38）］；分離菌中未檢測到大腸桿菌eaeA 基因、LT 基因、LT基因和Stx1 基因。

2.5 大腸桿菌耐藥基因的檢測

采用PCR 法檢測38 株E.coli 分離菌的8 種耐藥基因，結果檢測到6 種耐藥基因（見表5），其中以攜帶磺胺類耐藥基因的菌株數最多，sul2 基因占42.1%（16/38）；攜帶氯霉素類cmlA 基因和四環素類tet（B）基因的菌株數較少，所占比例分別為5.3%（2/38）和13.2%（5/38）；分離菌均未檢測到氨基糖苷類耐藥基因。

表5 分離菌株不同大腸桿菌耐藥基因檢測結果

3 討論

大腸桿菌是引起羔羊腹瀉和死亡的主要病原之一， 在養殖生產中一定程度上制約著養羊業的健康發展。 江婉琳等［11］從新疆克拉瑪依地區分離奶牛源大腸桿菌的系統發育群分型顯示B1 群占70.9%，未檢出B2 群。 顧曉曉［12］調查發現，新疆部分地區分離牛、 羊腸外致病性大腸桿菌系統發育群分型顯示多屬于A 和B1 群。 本試驗分離得到的大腸桿菌的系統發育群分型結果顯示，38 株大腸桿菌分離株具有多樣性，B1 群占68.4%，同樣未檢出B2 群，提示新疆地區牛、羊源大腸桿菌以B1群為優勢群。

大腸桿菌的致病性與攜帶的毒力基因密切相關。 劉英玉等［13］對庫爾勒地區2 個育肥場、1 個繁殖場中分離到的185 份羊源大腸桿菌進行毒力基因檢測，發現攜帶的毒力基因主要為Stx1 基因，為24.3%（45/185），未檢測出eaeA 基因。 佟盼盼等［14］對新疆部分地區養殖場、 屠宰場和市場中收集的202 份羊源大腸桿菌進行毒力基因檢測， 發現攜帶的毒力基因主要為Stx1 和hly， 所占比例為68.0%（17/25），未檢測出eaeA 基因。 趙學亮等［15］對陜西部分地區分離得到的50 株腹瀉羊源致病性大腸桿菌進行毒力基因檢測發現，eaeA 基因所占比例為32.0%（16/50），未檢出Stx1 基因。 王顯峰等［16］對內蒙古扎蘭屯地區45 株羊源大腸桿菌毒力基因檢測發現，irp2、fyuA 基因檢出率均為100%（45/45）、eaeA 基因為33.3%（15/45）、Stx1 為4.4%（2/45）。 本試驗對38 株腹瀉羊源致病性大腸桿菌毒力基因的檢測結果顯示，irp2 基因為47.4%（18/38）、hlyF 為36.8%（14/38）， 未檢測出Stx1 基因和eaeA 基因。上述研究結果表明致病性大腸桿菌菌株間攜帶的毒力基因不同可能與宿主來源和地區分布差異有關。

大腸桿菌耐藥性的增強主要與菌株間的接合、轉化及各耐藥基因間的水平傳播等有關，致使菌株呈現多重耐藥性［17］。 陳家露等［18］檢測西藏那曲市26 株羊源致病性大腸桿菌的耐藥基因，發現β-內酰胺類耐藥基因檢出率為100%（26/26）。 劉正明等［19］檢測內蒙古地區108 株羊源大腸桿菌的耐藥基因發現，β-內酰胺類耐藥基因檢出率為99.1%（107/108），氨基糖苷類、磺胺類和喹諾酮類耐藥基因檢出率均在50.0%以上。 顧曉曉等［20］檢測新疆石河子地區100 株羊源大腸桿菌氨基糖苷類耐藥基因，發現aph 和aadA 基因的檢出率分別為89%（89/100） 和98%（98/100）。 本試驗檢測和田地區38 株羊源大腸桿菌耐藥基因，發現磺胺類耐藥基因sul2 檢出率為42.1%（16/38），β-內酰胺類耐藥基因檢出率為18.4%（7/38），未檢出氨基糖苷類耐藥基因，這與上述報道存在一定的差異，提示不同地區的羊源大腸桿菌耐藥基因可能因羊的飼喂情況、用藥情況、菌株地理分布等因素而存在差異。因此，在臨床治療羔羊腹瀉時，應合理用藥，避免更多耐藥性的產生。

4 結論

該研究發現， 和田地區規?；B殖場腹瀉羔羊大腸桿菌感染率較高， 系統發育群主要為B1群，可攜帶多種毒力基因和耐藥基因，對綿羊的健康養殖存在一定危害。