基于16S rDNA 高通量測序方法檢測豬舍環境微生物群落多樣性

樊梅娜，張 修，王麗榮

（山東碧藍生物科技有限公司/山東省農業微生物技術創新中心，山東 泰安 271000）

我國是世界上最大的生豬生產和豬肉消費國［1］，豬肉生產和消費需求旺盛。 在當前非洲豬瘟疫情防控背景下，如何保障生豬養殖業健康發展成為亟須解決的重大問題［2］。2021 年農業農村部印發《非洲豬瘟等重大動物疫病分區防控工作方案》，提出“推動大區內非洲豬瘟等重大動物疫病無疫區、無疫小區和凈化示范場創建， 鼓勵連片建設無疫區，全面提升區域動物疫病防控能力和水平”。作為非洲豬瘟疫情防控中的重要一環， 維持良好的豬舍環境能夠有效減少病原菌滋生和疫病傳播［3］，因此，系統研究豬舍環境微生物多樣性至關重要。

傳統豬舍環境微生物的研究多采用空氣沉降、菌落平板計數等方法［4］，這些方法檢測精準度較低，往往只能進行特定病原微生物的檢測，無法全面、 系統地反映豬舍環境微生物群落組成及多樣性，更無法滿足高通量的檢測需求［5-6］。 隨著高通量測序技術的迅猛發展， 其成功解決了傳統方法檢測通量低、操作復雜等問題，廣泛應用于環境微生物的檢測當中［7］。 本研究基于16S rDNA 高通量測序技術， 通過分析不同類型豬舍的環境微生物多樣性，了解豬舍環境微生物的多樣性、相對豐度及主要病原菌屬的特性， 為提升豬舍疫病綜合防控能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑

Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer、GeneJET 凝膠回收試劑盒， 美國Thermo Fisher Scientific 公 司 產 品；TruSeq DNA Nano Kit，美國Illumina 公司產品；PowerSoilRDNA Isolation Kit，美國MIBIO 公司產品。

1.1.2 主要儀器

SimpliAmp PCR 儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司產品；Microplate reader FLx800 藍色熒光定量系統，美國Bio-Tek 公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗豬舍的選取及基本情況

從山東省某農業科技公司規?；B豬場選取保育豬舍（編號：BZ）、分娩豬舍（編號：RZ）和妊娠豬舍（編號：PM）3 種類型的豬舍，均為半封閉式結構，東西走向，自然通風為主，輔以機械通風，南北墻上均裝有窗戶，西墻裝有風機，東墻裝有濕簾。

保育豬舍共14 棟， 舍長25 m， 寬10 m，高2.5 m，面積為250 m2，舍內縱向有2 個飼養區，3個走道，共計24 個飼養單元，每單元安排15 頭4周齡左右的保育豬，共計360 頭。

分娩豬舍共8 棟， 舍長30 m， 寬20 m，高2.5 m，面積為600 m2，舍內縱向有4 個飼養區，5個走道，共有40 個飼養單元，每單元飼養1 頭分娩母豬以及10～15 頭15 日齡左右的哺乳仔豬。

妊娠豬舍共4 棟，舍長50 m，寬16 m，高2.5 m，面積為800 m2，舍內縱向有4 個飼養區，5 個走道，每列有65 個限位欄，共260 個限位欄，舍內共飼養妊娠母豬240 頭左右。

1.2.2 豬舍日常飼養管理

保育豬舍每日定時喂料4 次，清理糞便1 次，飼喂顆粒飼料，適量人工添加；分娩豬舍每日定時投料3 次，清理糞便2 次，飼喂粉狀飼料并根據飼喂情況人工適量添加； 妊娠豬舍每日定時投料1次，清理糞便1 次，采用自動料筒飼喂顆粒飼料。采樣期間保育豬舍、分娩豬舍、妊娠豬舍內平均溫度分別為25、24、21 ℃， 相對濕度分別為54%、68%、50%。

1.2.3 樣品采集

采樣時間為2021 年8 月，采樣位置設在每個豬舍的中央距離地面60 cm 處， 采用空氣沉降法采樣，每種類型的豬舍選取3 棟豬舍采樣，共9 個樣 本（BZ1、BZ2、BZ3、PM1、PM2、PM3、RZ1、RZ2、RZ3）。 采樣時， 采樣人員與豬舍人員均遠離培養皿，同時對采樣時間、溫度和濕度、光照以及風速進行記錄。 采樣完成后， 將培養皿裝入無菌封口袋，做好標記，帶回實驗室［8］。

圖1 97%相似度閾值下各樣品的稀釋性曲線

1.2.4 總DNA 提取與16S rDNA 高通量測序

采用PBS 緩沖液稀釋并溶解樣品，用Power-Soil DNA Isolation Kit 提取總DNA， 隨后送至山東開億基因科技有限公司，進行16S rDNA 高通量測序操作。

1.2.5 測序結果分析

將低質量測序序列排除， 在97%閾值下采用QIIME2 軟件將9 個樣品的有效序列聚類為不同操作分類單元（OTU），統計不同豬舍每個OTU 中的豐度信息。 計算α 多樣性指數， 包括Chao1 指數、Shannon 指數、 譜系多樣性指數； 分析樣品β多樣性， 利用Bray curtis 算法比較不同類型豬舍間物種群落結構差異。 利用QIIME2 軟件對豬舍環境樣品在門和屬分類水平上細菌群落的組成和結構進行分析。

2 結果與分析

2.1 豬舍環境樣品測序結果及稀釋曲線

在過濾掉低質量序列后，9 個樣品的有效序列總數為948 595 個，平均測序讀長在463～473 bp。在97%相似度閾值下將其聚類為不同OTU， 統計得到不同豬舍樣本在不同OTU 中的豐度信息。 9個樣品共產生29 126 個OTU（見表1），涵蓋了31門66 綱160 目320 科899 屬1 831 種的細菌。 9個樣品的稀釋曲線如圖1 所示， 隨著取樣數量的增加， 曲線已趨于平緩， 提示所采集樣品的OTU的覆蓋度已經基本飽和，表明取樣深度合理。

表1 豬舍環境樣本的序列信息

2.2 豬舍環境樣品的微生物多樣性分析

2.2.1 α 多樣性分析

α 多 樣 性 指 數 包 含Chao1 指 數、Shannon 指數、譜系多樣性指數等，通過綜合分析OTU 豐度等信息反映物種多樣性信息。 由表1、表2 綜合分析可知，不同豬舍的物種多樣性存在差異，分娩豬舍以及保育豬舍的Chao1 指數、Shannon 指數及譜系多樣性指數整體高于妊娠豬舍。

表2 豬舍環境樣品微生物α 多樣性指數

2.2.2 β 多樣性分析

β 多樣性分析可以衡量樣品在菌群結構多樣性方面的差異大小。Bray curtis 的計算結果將系統進化距離的差異顯示在三維空間中， 可以作為β多樣性的參照。以不同豬舍環境微生物為樣品，對各樣品的距離矩陣進行主成分分析， 得到β 多樣性的主坐標分析（PCoA）結果，如圖2 所示，3 個類型豬舍空間距離相隔較遠， 表明菌群結構差異較大；與保育豬舍相比，妊娠豬舍和分娩豬舍各樣品之間菌群結構差異較小。

圖2 不同類型豬舍環境樣品微生物β 多樣性的主坐標分析（PCoA）圖

2.3 豬舍環境樣品微生物群落組成分析

2.3.1 細菌門分類水平的比較

如圖3 所示，變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteriota）為四大優勢菌群，但在不同豬舍中相對豐度各有不同：妊娠豬舍中，變形菌門相對豐度最高，平均達到43%，厚壁菌門和放線菌門的平均相對豐度分別為32%和20%， 擬桿菌門平均相對豐度為4%；分娩豬舍中，變形菌門平均相對豐度達到93%，擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門平均相對豐度相差不大，分別為3%、2%、0.6%；保育豬舍中，變形菌門平均相對豐度為67%，厚壁菌門和擬桿菌門平均相對豐度分別為21%和9%，放線菌門平均相對豐度僅為1%。 結果表明，變形菌門在3 個類型的豬舍中相對豐度均最高， 厚壁菌門、 放線菌門以及擬桿菌門相對豐度在不同類型豬舍中差異較大。

圖3 不同類型豬舍環境樣品細菌門分類水平的比較

2.3.2 細菌屬分類水平的比較

如圖4 所示，9 個樣品共得到47 種細菌類群，其中，不動桿菌屬（Acinetobacter）和假單胞桿菌屬（Pseudomonas）在3 個類型的豬舍相對豐度均較高， 平均達5%以上； 寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas） 在保育豬舍中相對豐度最高，平均達到12%；棒桿菌屬（Corynebacterium）在妊娠豬舍中相對豐度最高，平均達到14%；叢毛單胞菌屬（Comamonas）和苯基單胞菌屬（Phenylobacterium）在分娩豬舍平均相對豐度都為10%，僅次于平均相對豐度為19%的不動桿菌屬； 其余各菌屬相對豐度較低。

圖4 不同類型豬舍環境樣品細菌屬分類水平的比較

2.4 豬舍環境群落結構的差異分析

為了探究不同豬舍環境樣本與微生物群落結構之間的關系， 本研究在31 個不同門類水平上，構建了樣品聚類關系樹，并以熱圖（heatmap）的形式展現。如圖5 所示，放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門在分支上相近， 且大多為紅色或黃色方塊，進一步表明這四個菌門豐度相對較高。

圖5 熱圖分析（門水平）

2.5 豬舍空氣中病原菌的分布

通過對豬舍環境空氣樣本進行屬水平上的細菌多樣性分析發現（見圖4），采樣豬舍空氣中存在一些潛在的動物致病菌屬， 主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、寡養 單 胞 菌 屬 （Stenotrophomonas）、 嚴 格 梭 菌（Clostridium_sensu_stricto_1）、 棒 桿 菌 屬（Corynebacterium）、 短 波 單 胞 菌 屬（Brevundimonas）、特呂佩爾菌屬（Trueperella）、創傷球菌屬（Helcococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、軍團菌屬（Legionella）、沙雷菌屬（Serratia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）。 上述動物潛在致病菌的臨床意義見表3。

表3 豬舍環境微生物中潛在動物病原菌的臨床意義

3 討論

目前，非洲豬瘟疫情防控形勢依然嚴峻，該病對我國生豬養殖業的影響還在繼續。 本研究基于16S rDNA 高通量測序方法，系統分析了規?；i場不同類型豬舍環境微生物的多樣性， 基于97%的相似規律共得到OTU 29 126 個， 涵蓋了31 門66 綱160 目320 科899 屬1 831 種的細菌。 李紅梅等［23］利用16S rDNA 高通量測序方法研究了四川省大型規?；i場環境微生物多樣性， 基于97%的相似規律共得到OTU 27 276 個， 有16 門115 科217 屬被鑒定， 本研究揭示的豬舍環境微生物多樣性更加豐富。

本研究樣品采集自規?；i場3 種不同類型的豬舍， 樣品16S rDNA 高通量測序結果表明，不同類型豬舍的環境微生物多樣性存在差異， 分娩豬舍以及保育豬舍在微生物種類、系統進化多樣性以及豐富程度上高于妊娠豬舍； 樣品群落組成分析也表明，厚壁菌門、放線菌門以及擬桿菌門的相對豐度在3 個類型的豬舍間差異較大， 這可能與養殖密度、豬只營養條件及腸道微生物組成［24-25］、舍內空氣流通方式等多種因素相關。

具體到屬水平， 不同豬舍在菌群組成和結構上也有所不同。本研究結果表明，寡養單胞菌屬在保育豬舍中相對豐度最高，平均達到12%。張鵬飛等［26］研究表明，該屬典型菌嗜麥芽窄食單胞菌可導致豬只出現呼吸困難、氣喘急促等癥狀；李超等［27］對豬舍環境微生物氣溶膠含量與構成進行分析時發現， 該屬細菌在研究的5 個不同養豬環境中均能檢測到，含量高達45.5%～81.9%。 本研究結果表明，棒桿菌屬在妊娠豬舍中豐度可達14%。張永燦［28］研究表明，棒桿菌屬細菌存在于公豬包皮中，可通過配種感染妊娠母豬，嚴重影響豬只生長速度和生產性能。本研究結果表明，分娩豬舍中不動桿菌屬豐度最高。 邱立等［29］在研究陜西省某規?；i場仔豬腹瀉病原菌時分離到該菌屬內的鮑曼不動桿菌，該菌可寄生于仔豬體內，感染后并不能誘導免疫反應，從而導致長期慢性感染。 上述3個屬的細菌均為條件致病菌， 在養殖環境惡化以及豬只營養不良、免疫力低下時可能會感染宿主，從而造成疫病暴發，養殖效益下降［30］。

本研究表明，豬舍環境微生物種類繁多，在發現的潛在動物致病菌中，有些致病力比較強，如假單胞菌屬 （Pseudomonas）、 鏈球菌屬（Streptococcus）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）等，值得注意的是，軍團菌屬（Legionella）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等的致病性在人上亦有報道［31-32］。 另有研究發現，變形菌門中的大腸桿菌能傳播到距離豬舍100 m以外的居民住宅區和養殖場［33］。因此，規?；i場的養殖環境不僅影響動物健康狀況， 而且也會對豬場工人和周邊居民的健康造成嚴重威脅。 研究豬舍環境微生物的組成、豐度以及病原菌差異，對于規?；i場防止病原滋生、 阻斷疫病傳播方面具有重要作用。

4 結論

規?；i場不同類型豬舍環境微生物多樣性豐富，變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門為四大優勢菌群。 分娩豬舍以及保育豬舍在細菌種類、 系統進化多樣性以及豐富程度上高于妊娠豬舍。 研究發現的豬舍環境中潛在動物致病菌屬為豬舍環境消毒的藥物選擇提供了依據。