蒙藥紅花清肝13 味丸治療CCl4 誘導小鼠腸道損傷的轉錄組測序分析研究

魏媛媛，紅 梅，王海生

（內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110）

腸道不僅發揮對營養物質的消化吸收功能，還對維持體內環境穩態起重要調節作用。 腸道黏膜屏障能夠阻止腸道內致病菌、 外來抗原和內毒素等的移位，防止機體受到侵襲，同時吸收機體所需的營養物質［1-2］。 研究表明，缺血、缺氧、感染性疾病、缺血再灌注損傷、內毒素水平增加、應激反應、膽汁、化學物質、電離輻射、腸道微生態紊亂等均可引起腸道損傷［3-5］。

蒙藥紅花清肝13 味丸又名古日古木-13，由紅花、人工牛黃、麥冬、訶子、蓮子、銀朱、丁香、人工麝香、紫檀香、木香、川楝子、水牛角濃縮粉、梔子13 種藥材組成， 主要成分紅花具有活血化瘀、抗炎、抗氧化、止痛、鎮靜、清除氧自由基、調節血脂、保護腦組織、擴張小動脈、增加組織血流量、抗纖維化、保護神經、改善機體微循環和提高免疫力等作用［6］。

筆者所在課題組前期研究發現， 蒙藥紅花清肝13 味丸對肝損傷具有保護作用［7］。 炎癥、門靜脈高壓、 腸道微生物組成變化均可導致腸道通透性增加，致使內毒素移位，引起肝臟中多種促炎基因和細胞因子的轉錄激活。由于腸道屏障受損，大量細菌及其代謝物如脂多糖（LPS）通過肝腸循環進入肝臟。蒙藥紅花清肝13 味丸經肝腸軸進入體內，是否能夠對腸道損傷起到保護作用？該研究通過建立小鼠四氯化碳（CCl4）腸道損傷模型，利用高通量轉錄組測序技術，篩選CCl4引起小鼠腸道損傷及蒙藥紅花清肝13 味丸治療過程中涉及的重要信號通路及基因，以期為揭示紅花清肝13 味丸預防及治療腸道疾病的分子機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6～8 周齡雄性C57BL/6 小鼠18 只，體重20～22 g，購自北京維生河實驗動物科技有限公司。 蒙藥紅花清肝13 味丸，購自內蒙古國際蒙醫醫院。 根據參考文獻［8］中的計算公式，小鼠給藥劑量根據該藥物的成人日劑量50 mg/（kg·BW）推算，確定為616.5 mg/（kg·BW）。 CCl4﹑橄欖油﹑PBS﹑生理鹽水購自上海阿拉丁公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 分組及處理

將18 只小鼠隨機分為3 組，每組6 只，分別為空白對照組、模型組和治療組?？瞻讓φ战M與模型組每天灌胃1 次生理鹽水，劑量為10mL/（kg·BW），連續7 d； 治療組小鼠每天灌胃1 次紅花清肝13味丸，劑量為616.5 mg/（kg·BW），連續14 d；最后一次灌胃4 h 后，對照組腹腔注射橄欖油，模型組和治療組腹腔注射CCl4橄欖油混合物（CCl4∶橄欖油=1∶4，V/V），劑量均為10 mL/（kg·BW）。 腸道損傷處理后第2 天， 將3 組小鼠用乙醚麻醉后安樂死（頸椎脫臼法）。 記錄所有小鼠體重并取十二指腸組織。

1.2.2 轉錄組測序及數據分析

將十二指腸組織用RNase-free 水沖洗后吸干表面水分，放入液氮中速凍一段時間后置于-80 ℃冰箱中保存。 將組織樣品送諾禾致源公司進行全基因轉錄組測序。 RNA 提取及質量檢測合格后，進行Illumina 測序。 對于有生物學重復的樣本，使用DESeq2 軟件（1.20.0）進行2 個比較組合之間的差異表達分析。采用clusterprofile 軟件對差異基因集進行KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。 KEGG 通路富集以padj小于0.05 作為顯著性富集的閾值。

2 結果與分析

2.1 小鼠十二指腸組織的轉錄組測序結果

對小鼠十二指腸轉錄組測序， 差異表達基因聚類熱圖顯示（見圖1），空白對照組﹑模型組和治療組腸道組織均能較好地聚在一起，其中，治療組與空白對照組距離較近，而模型組與空白對照組距離較遠。差異表達基因柱狀圖及火山圖顯示，與空白對照組相比，模型組差異表達基因數量為1 419個， 其中， 上調表達基因744 個， 下調表達基因675 個（見圖2 及圖3A）；與空白對照組相比，治療組差異表達基因為2 875 個，其中，上調表達基因1 362 個， 下調表達基因1 513 個 （見圖2 及圖3B）；與模型組相比，治療組獲得了2 288 個差異表達基因，其中，上調表達基因1 139 個，下調表達基因1 149 個（見圖2 及圖3C）。

圖1 不同組別小鼠十二指腸組織差異表達基因聚類熱圖

圖2 不同組別小鼠十二指腸組織差異表達基因數量統計

圖3 差異表達基因火山圖

進一步對模型組差異表達基因進行KEGG 富集分析，發現B 細胞信號通路﹑破骨細胞分化信號通路﹑炎癥性腸病信號通路﹑趨化因子信號通路及JAK-STAT 信號通路等被激活（見圖4）。對治療組差異表達基因進行KEGG 富集分析， 發現mTOR信號通路﹑FOXO 信號通路及長壽調節信號通路等被激活（見圖5）；破骨細胞分化信號通路﹑細胞凋亡信號通路等被抑制（見圖6）。

圖4 CCl4 損傷腸道后被激活的信號通路

圖5 紅花清肝13 味丸治療后被激活的信號通路

圖6 紅花清肝13 味丸治療后被抑制的信號通路

2.2 轉錄組數據與蒙藥紅花清肝13 味丸藥物靶點互交分析

為了尋找蒙藥紅花清肝13 味丸治療CCl4致腸道損傷中發揮重要作用的基因， 經HERB 數據庫搜集紅花清肝13 味丸作用靶點基因，篩選出的靶點基因有143 個。對紅花清肝13 味丸治療后顯著差異表達基因進行生物信息學分析， 發現下調基因有155 個。 將分析得到的兩組基因群通過String 數據庫進行蛋白質互作網絡（PPI）分析，結果如圖7、圖8 所示。 進一步對兩組關鍵蛋白互交分析， 得到藥物靶點基因和轉錄組靶點基因的共靶點基因，從中篩選出在轉錄組數據中表達量存在顯著差異的JUN﹑STAT1﹑NFKBIA、FOS 基因， 結果如圖9 所示。

圖7 紅花清肝13 味丸作用靶點基因

圖8 RNA-Seq 蛋白互作網絡圖

圖9 紅花清肝13 味丸作用靶點與轉錄組靶點互交分析結果

3 討論

腸道是機體重要的免疫系統之一， 人體免疫力與腸道密切相關。 腸道組織受損可引起多種疾病， 若不及時治療可能會引起機體多器官功能障礙［9］。 研究表明，蒙藥在腸道黏膜屏障損傷后的修復中有重要作用［10］。 目前蒙藥在臨床中的應用越來越廣泛，許多蒙藥能夠改善腸道菌群失調，增強腸道黏膜免疫屏障功能，減輕腸道炎癥反應，促進腸道黏膜損傷的修復［11］。 為了尋找更多的治療靶點，近年來腸道組學測序研究越來越受到關注。在一項黃水多糖對Caco-2 細胞腸道屏障損傷的保護作用機制研究中，經轉錄組測序發現，表達差異顯著的基因主要富集于MAPK﹑Toll 樣受體和NFκB 等信號通路［12］。在C 型產氣莢膜梭菌外毒素致小鼠腸道損傷的轉錄組分析中發現， 表達差異顯著的基因主要富集在TNF、IL-17、p53、FOXO、Toll樣受體和NF-κB 等信號通路［13］。

JAK-STAT 信號通路是真核細胞中重要的信號通路，當宿主發生細菌感染時，機體中IFN-γ 激活JAK，進一步磷酸化STAT1，活化的STAT1 轉移到細胞核中，促進多種靶基因的轉錄。 JAK-STAT信號通路參與抗炎作用， 阻止致病菌或內毒素的入侵；同時也可以促進或加重機體炎癥反應［14-15］。

mTOR 信號通路受多種細胞信號的調控。 研究發現，雙歧桿菌可改善UC 小鼠的結腸損傷，增加腸道菌群的多樣性， 這可能與激活VIP/cAMP/PKA 信號通路、抑制mTOR 信號通路有關［16］。 研究表明， 產腸毒素大腸桿菌K88 能夠激活mTOR信號通路， 而丁酸梭菌能夠通過介導mTOR 信號通路緩解產腸毒素大腸桿菌K88 感染IPEC-J2 細胞引起的炎癥反應， 并提高緊密連接蛋白的表達量，從而減輕細胞損傷［17］。

FOXO 信號通路的激活對腫瘤發生、 壽命調節、代謝調節等具有重要作用。 Cheng 等［18］利用黏膜蛋白質組學技術和糞便微生物群移植方法研究了外源性微生物對產腸毒素大腸桿菌K88 感染仔豬模型腸道功能的影響， 發現FOXO 信號通路顯著上調。 Zhang 等［19］研究表明，FOXO 信號通路主要參與模擬運輸應激誘導的鴨腸道損傷機制。

NF-κB 抑制因子α（NFKBIA）參與調節NFκB 信號通路， 靜息狀態下NFKBIA 位于細胞質中， 當機體受到刺激時，NFKBIA 發生磷酸化，繼而使NF-κB 從三聚體中釋放出來并進入細胞核，調控下游基因轉錄及炎癥因子的分泌。 改善腸道菌群的豐富度和組成比例， 可有效降低LPS 在腸道黏膜中的滲透， 使腸道組織中NF-κB 的表達水平下調，改善糖、脂代謝及炎性因子關鍵調控基因和調控蛋白的表達， 從而降低炎癥反應程度，同時可改善胰島素抵抗水平，最終調節機體物質代謝和炎癥反應［20］。研究表明，CCl4可通過誘導MAPK/NF-κB 信號通路中相關基因的表達，促進炎癥發生發展［21］。 同時，CCl4可誘導JUN 表達上調［22］。

4 結論

篩選出了參與小鼠CCl4腸道損傷及蒙藥紅花清肝13 味丸治療過程的FOXO﹑mTOR﹑JAKSTAT 等重點信號通路和JUN﹑STAT1﹑NFKBIA、FOS 重點基因，為明晰紅花清肝13 味丸預防及治療腸道損傷的分子機制提供了參考。