利用小麥-黑麥1BL.1RS易位系快速篩選F2群體中攜帶抗條銹病基因Yr15的純合個體

鄒 楊，符書蘭，唐宗祥

（四川農業大學農學院/四川農業大學植物遺傳育種省級重點實驗室，成都 611130）

條銹病是危害小麥生產的真菌性病害。利用抗病基因是防治小麥條銹病最經濟、有效的途徑。對已有的條銹病抗性基因進行評價，可為條銹病抗性基因的應用提供參考。對103份攜帶已知抗性基因的小麥品系進行條銹病抗性鑒定，結果表明僅Yr5、Yr15和Yr45對我國當前流行的生理小種表現全生育期抗性[1]。這些基因為小麥條銹病抗性育種提供了很好的資源。早在2007年就有報道指出，四川的小麥育種者已利用Yr5和Yr15進行小麥條銹病抗性育種，而且對Yr15的利用更多[2]?？剐曰験r15來自野生二粒小麥[3]，被定位在1B染色體短臂（1BS）遠端[4]，并且該基因已被克隆[5]。盡管Yr15對條銹病具有很好的抗性，但就全國范圍而言，還沒有被大量應用。對107個不同年份審定的山東小麥品種以及2019—2020年參加山東省區試的126 份品系進行了抗條銹病基因的檢測，沒有發現Yr15的存在[6-7]。在243 份云南普通小麥地方品種中，也沒有檢測到Yr15的存在[8]。青海的少量小麥品種（系）含有Yr15基因[9]。這些研究表明，Yr15還可以充分加以利用。

在利用抗病基因Yr15進行小麥育種的過程中，從分離世代中快速檢測純合個體有利于加快其應用進程。雖然Yr15有了相應的功能標記[5]，可以被用來準確鑒定植株是否含有該基因，但該標記無法區分純合與雜合植株[5]。因而在進行選擇時，只能混收雜合植株和純合植株，這會增加后續選擇的工作量。另外，利用分子標記進行檢測，涉及DNA 提取、PCR和電泳等較為繁瑣的過程。為了克服分子標記的缺點，可以探索一種新的途徑，既可以起到分子標記的效果，又能快速區分含抗病基因的純合與雜合個體?；诖?，本研究利用Yr15位于1BS上的特點，以含該基因的品系為親本，與感病的小麥-黑麥1BL.1RS 易位系雜交，然后利用基于寡核苷酸探針的簡便ND-FISH技術[10]，對F2分離群體進行鑒定。簡便ND-FISH 技術不需提取基因組DNA，也不需要PCR和電泳過程，可以利用根尖或幼嫩葉片快速簡便地獲得間期細胞核，然后利用特異寡核苷酸探針對間期細胞核進行ND-FISH分析[10]，可以快速排除含1BL.1RS 易位染色體的植株，從而確定含Yr15基因的純合個體。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為抗條銹病小麥品系F6718和感條銹病小麥-黑麥1BL.1RS 易位系21T248-21。品系F6718 不含1BL.1RS 易位染色體，其系譜為20828-11/13-3Y-2。20828-11高抗條銹病，由中國科學院成都生物所吳瑜研究員提供。13-3Y-2 來自綿陽11與黑麥Kustro 的雜交后代，為1R 單體附加系，高感條銹病。21T248-21為13-3Y-2的輻射后代。普通小麥中國春用作基因檢測的對照。

1.2 試驗方法

1.2.1 條銹病抗性鑒定

以1BL.1RS 易位系21T248-21 為母本，品系F6718為父本雜交，F1植株套袋自交獲得F2群體，種于溫江公平鎮。用混合條銹菌CYR32、CYR33 和CYR34對親本、F1和F2植株進行接種鑒定。成株期按照0～9級標準判定條銹病抗感情況[11]。

1.2.2 細胞學鑒定

利用ND-FISH技術對F6718、21T248-21以及F1植株的根尖中期染色體進行細胞學鑒定。根尖中期染色體制備參照Han F.等描述的方法[12]。ND-FISH參照Fu S.等描述的方法[13]。所用探針為OligopSc119.2-1[14]和Oligo-1RNOR[10]。此外，剪取F2單株的根尖或幼嫩葉片，采用簡便ND-FISH方法對F2單株進行細胞學分析，各步驟參照張蔚等的方法執行[10]。

1.2.3 分子標記檢測

供試材料F6718、21T248-21、20828-11、綿陽11、中國春以及F6718 與21T248-21 雜交后代的基因組DNA 提取參照已報道的改良方法[15]。利用檢測Yr15特異的功能標記Y15K1_F2:GGA GAT AGA GCA CAT TAC AGA C; uhw301R:TTT CGC ATC CCA CCC TAC TG 對基因組DNA 進行擴增[5]。PCR程序和瓊脂糖電泳參照習玲等報道的方法執行[8]。

2 結果與分析

2.1 親本F6718、21T248-21 和F1植株細胞學及條銹病抗性鑒定

探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-1RNOR相結合能夠識別小麥1B染色體和小麥-黑麥1BL.1RS易位染色體。探針Oligo-1RNOR 能夠特異性地在黑麥1RS臂的核仁組織區產生信號[10]。根據這兩個探針的信號，可以看出小麥品系F6718 含1 對1B 染色體（圖1A），而21T248-21 含1 對1BL.1RS 易位染色體（圖1B）。來自F6718×21T248-21的F1植株含1條1B染色體和1條1BL.1RS易位染色體（圖1C）。田間條銹病抗性鑒定表明，親本F6718和雜交F1植株高抗條銹?。▓D1D），親本21T248-21高感條銹?。▓D1D）。

圖1 親本F6718、21T248-21以及雜交F1的根尖中期染色體ND-FISH分析和條銹病抗性鑒定Figure 1 ND-FISH analysis of the root-tip metaphase chromosomes of F6718,F1 plant and 21T248-21,and stripe rust resistance test

2.2 F2代植株細胞學及條銹病抗性鑒定

以Oligo-1RNOR為探針，用簡便ND-FISH方法對F6718 和21T248-21 的雜交F2植株進行細胞學鑒定。共鑒定了188 個單株。其中46 個單株沒有Oligo-1RNOR 信號，表明這些植株含1 對1B 染色體，不含1BL.1RS 易位染色體（圖2A）。106 個單株中都只觀察到1個Oligo-1RNOR信號（圖2B），表明這些植株含1條1B染色體和1條1BL.1RS易位染色體。在36 個單株中觀察到2 個Oligo-1RNOR 信號（圖2C），因而這些植株含1對1BL.1RS易位染色體。由此可以看出，利用寡核苷酸探針Oligo-1RNOR和ND-FISH技術對葉片間期核進行分析，能夠排除分離群體中含Yr15基因的雜合個體。F2分離群體中，凡是含1對1BL.1RS易位染色體的植株都高感條銹病，其余的都高抗條銹?。▓D2D，E）。隨機選取3株含1對1B染色體植株套袋自交，從每株自交后代中隨機選取60 粒種子種于溫江，經接種鑒定，都高抗條銹病，沒有發現抗感分離的情況。這表明這些植株含純合的抗病基因。

圖2 簡便ND-FISH技術分析F2植株的葉片間期細胞及植株條銹病抗性鑒定Figure 2 Simple ND-FISH analysis of interphase cells derived from leaves of F2 plants and stripe rust resistance test

2.3 確定F6718中的抗病基因

根據F2分離群體的染色體組成和抗病情況，可以推測F6718的1B染色體攜帶條銹病抗性基因，估計該基因為Yr15的可能性較大。因此利用Yr15特異的功能標記對參試材料進行了擴增。在F6718、20828-11、雜交F1植株以及含1B 的F2植株中都擴增出了目標條帶，而在21T248-21、綿陽11和含1對1BL.1RS 易位染色體的F2植株中沒有擴增出條帶（圖3）。這一結果表明F6718含有Yr15基因，該基因來源于20828-11。

圖3 用特異分子標記檢測供試材料中的Yr15基因Figure 3 Detecting the presence of gene Yr15 in the materials used in this study using its specific marker

3 討論

條銹病抗性基因Yr15對當前流行的條銹菌生理小種仍具有很好的抗性[1]。本研究所用的小麥品系F6718 含Yr15基因，可以用作條銹病抗性育種的親本。小麥育種過程中，通過有性雜交進行抗病基因的轉育仍然是小麥抗病育種的主要途徑。為此，盡早在F2分離群體中確定純合抗病個體可減少后續選擇的盲目性，從而減少選擇的工作量。分子標記是檢測小麥植株是否含有目標基因的常用方法[6-8]。然而，利用分子標記進行篩選時，會出現含有抗性標記目標條帶的材料不一定含有相應抗病基因的情況[2,16]。而且，Yr15的功能標記不能鑒別分離群體中的雜合個體和純合個體。就Yr15基因而言，本研究利用1BL.1RS 易位染色體和簡便NDFISH技術，可以快速準確地鑒別分離群體中含Yr15基因的雜合個體和純合個體，從而針對純合Yr15個體進行選擇。其原理為：F1植株的減數分裂過程中，1B 染色體長臂（1BL）能與1BL.1RS 易位染色體中的1BL臂配對重組，確保F1植株中的1B染色體和1BL.1RS 易位染色體能在減數分裂過程中正常分離。而1BS 和1RS 不會發生重組，這就保證1BS 染色體臂攜帶的Yr15基因不會被重組掉。繼而通過簡便ND-FISH 方法，快速準確排除F2群體中含1BL.1RS 易位染色體的植株，確定含1 對1B 染色體的植株，這些植株中Yr15基因處于純合狀態，其條銹病抗性在后續世代中不會出現分離，這就減少了選擇的工作量。就1BL.1RS 易位染色體而言，盡管目前已有分子標記能對其進行鑒定，而且也能區分植株含1條還是1對1BL.1RS易位染色體[17]。然而，以上所述基于分子標記的方法都涉及基因組DNA提取、PCR 和電泳過程，略顯繁瑣。本研究基于寡核苷酸探針的簡便ND-FISH 方法，不需要基因組DNA 的提取、PCR 和電泳過程，能快速鑒定植株中的目標染色體，其方便快捷的特點已發文詳述[10]。當從不同雜交組合的F2群體中鑒定出純合抗病個體后，它們還可以作為親本相互雜交，一方面增加了遺傳多樣性，同時也保證了目標基因在雜交后代中也處于純合狀態。

這一方法也可以用于其他染色體攜帶的抗病基因。目前已創制了不少小麥-黑麥易位染色體[18]，都可以加以利用。比如，為了利用位于2B 染色體長臂上的條銹病抗性基因Yr5，可以用感病的小麥2B 染色體長臂（2BL）與黑麥染色體形成的易位系為親本，與含Yr5的抗病材料雜交，用同樣的原理和方法從F2分離群體中排除含小麥-黑麥易位染色體的植株，保留不含小麥-黑麥易位染色體的植株，就獲得了含Yr5基因的純合個體。為此，在今后的小麥-黑麥遠緣雜交后代的鑒定中，可以保留不抗病的小麥-黑麥易位系。這些易位系不但可以幫助驗證抗病基因染色體定位的正確性，還可以從F2分離群體中快速篩選純合抗病個體。事實上，就鑒定含Yr15基因的純合個體而言，只要明確了某一材料含有Yr15基因，用作親本的1BL.1RS易位系也可以是抗病的，因為這不影響判斷植株是否含有1 對1B 染色體，因而也不影響判斷植株是否含1對Yr15基因。用其他小麥-黑麥易位染色體選擇相應染色體攜帶的抗病基因也是如此。然而，該方法的缺陷在于：為了增加小麥背景的遺傳多樣性，需要事先將小麥-黑麥易位染色體轉移到不同的小麥背景。

4 結論

利用小麥-黑麥1BL.1RS 易位系，借助基于寡核苷酸探針的簡便ND-FISH 技術，可以快速準確地從F2分離群體中鑒定出含Yr15的純合抗病個體。此方法也適用于其他抗病基因的純合個體的篩選。