基于層次分析法及多指標正交試驗優選消疳健胃合劑水提工藝

張樂怡,張曉芹,王慧玉,雷后興

(浙江中醫藥大學附屬麗水市中醫院藥劑科·浙江 麗水 323000)

小兒疳證是指由于喂養不當或罹患他病導致小兒脾胃受損,運化失健,氣液耗傷,肌膚筋骨經脈臟腑失養而形成的一種慢性消耗性疾病,是兒科的四大病癥之一[1-3]。隨著國內對民族醫藥的關注與深入研究,近年來,畬醫藥在小兒疳證等多種疾病的治療中取得了良好的進展[4-8]。消疳健胃方為畬族民間驗方,經畬醫的民間應用和本院前期臨床應用表明,該方具有消食化積、健脾和胃的功效,對小兒疳癥、食積、食欲改善等病癥具有較好的臨床治療效果[2]。消疳健胃方由食涼茶、陳皮、山楂、茯苓、麥芽、稻芽、雞內金組成。其中食涼茶為畬族特有藥材,在民間畬族常用其治療傷食所致的痞滿證和慢性胃炎,在臨床上對于風熱表證、脾虛食滯、胃脘痛、泄瀉、吞酸等病癥均具有較好的治療效果[9-11],為方中君藥。陳皮具有理氣健脾功效,常用于脘腹脹滿,為方中臣藥。研究表明,山柰酚-3-O-蕓香糖苷為君藥食涼茶的主要化學成分,具有抗氧化、抑制脂肪合成、減輕急性肝損傷等作用,常作為食涼茶質量特征的表征成分[12-15];橙皮苷、川陳皮素為陳皮主要活性成分,具有興奮胃腸道、促進胃排空、抑制腸上皮細胞炎性損傷、改善代謝紊亂、抗病毒等作用,常作為陳皮質量特征的表征成分[16-20]。本文在文獻考證的基礎上,選擇君藥和臣藥的主要化學成分進行制劑的整體質量考察。

該方原劑型為湯劑,煎煮不當容易影響后續藥效,且不易保存、攜帶不便。因此本研究參考消疳健胃湯的組方特點和臨床應用形式,考察該方劑的水提取工藝,結合層次分析法進行正交設計試驗,優選消疳健胃合劑最佳提取工藝,為該制劑的制備提供參考。

1 實驗材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀,配置Empower 3 Personal Single System SW化學工作站：Waters公司,美國;Smart2Pure Pro型超純水機：Thermo Electron LED GmbH公司,德國;十萬分之一電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司;TC-15系列恒溫電熱套：海寧市華星儀器廠。

1.2 試藥與試劑 橙皮苷(批號：110721-201818,純度96.2%)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號：112007-201602,純度90.8%)、川陳皮素(批號：112055-202001,純度99.6%)標準品均由中國食品藥品檢定研究院提供。實驗用的中藥飲片均來源于本單位中藥庫,經本單位中藥飲片驗收小組驗收,食涼茶符合2015年版《浙江省中藥炮制規范》,其余均符合《中國藥典》2020年版的相關規定;見表1。乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑為分析純。

表1 中藥飲片信息

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters XTERRA C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速1.0 mL·min-1,進樣量10 μL,柱溫：30 ℃,檢測波長230 nm;流動相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B),梯度洗脫,(0～10 min,5%A→15%A;10～20 min,15%A→21%A;20～25 min,21%A→22%A;25～30 min,22A%→23%A;30～35 min,23%A→30%A;35～45 min,30%A→48%A;45～55 min,48%A→55%A;55～60 min,55%A→5%A);理論塔板數按山柰酚-3-O-蕓香糖苷計算不低于3500。

2.1.2 混合對照品溶液制備 精密稱取橙皮苷7.50 mg置于20 mL容量瓶中,山柰酚-3-O-蕓香糖苷10.30 mg、川陳皮素10.80 mg,置于10 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即分別得對照品母液。分別精密量取一定量的對照品母液至10 mL容量瓶中,制成含橙皮苷23.45 mg·L-1、山柰酚-3-O-蕓香糖苷51.44 mg·L-1、川陳皮素10.76 mg·L-1的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取消疳健胃合劑水煎液1 mL,用甲醇定容至10 mL,用0.22 μm微孔濾膜濾過,作為供試品溶液。

2.1.4 陰性對照品溶液制備 按處方中比例稱取各藥材,分別制備缺食涼茶陰性對照樣品,缺陳皮陰性對照樣品,缺食涼茶、陳皮陰性對照樣品,按“2.1.3”項下方法制備陰性對照溶液。

2.1.5 專屬性試驗 精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液、陰性對照品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進樣。結果表明,在供試品溶液色譜圖中,在與對照品溶液色譜相應保留時間處有相同色譜峰出現,峰形良好,且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 專屬性檢查色譜圖(1.橙皮苷;2.山柰酚-3-O-蕓香糖苷;3.川陳皮素)

2.1.6 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液,在“2.1.1”色譜條件下,分別進樣1,3,5,10,15,20 μL,以峰面積為縱坐標(Y),各組分含量為橫坐標(X),繪制標準曲線,結果見表2,可知在線性范圍內,3個組分的峰面積與進樣量線性關系良好。

表2 回歸方程及線性范圍

2.1.7 儀器精密度試驗 精密量取10 μL混合對照品溶液,在“2.1.1”項色譜條件下,連續進樣6 次,測得橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、川陳皮素的峰面積RSD分別為0.85%、0.95%、0.87%,表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復性試驗 取同一批水煎液,按“2.1.3”項下方法,平行制備6份供試品溶液,在“2.1.1”項色譜條件下測定,測得橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、川陳皮素峰面積RSD分別為2.35%、2.57%、2.51%,表明此方法重復性良好。

2.1.9 溶液穩定性試驗 取同一份供試品溶液,在“2.1.1”項色譜條件下,于0,3,6,9,12,18 h分別進樣,測得橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、川陳皮素峰面積RSD分別為2.38%、2.00%、2.00%,表明在18 h內,該溶液穩定。

2.1.10 加樣回收率試驗 精密吸取已知各組分含量的供試品溶液,共6 份,分別加入約等量成分的對照品溶液,按“2.1.3”項制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件測定,測定結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.2 水提工藝試驗

2.2.1 因素水平 查閱文獻,選擇浸泡時間(A)、加水量(B)、提取時間(C)、提取次數(D)作為影響因素[21-25],因素水平見表4。

表4 因素水平表

2.2.2 層次分析法確定權重[26-28]根據復方中食涼茶為君藥、陳皮為臣藥的君臣佐使配伍關系及活性成分藥理作用,選取橙皮苷(Y1)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(Y2)、川陳皮素(Y3)的含量(μg)和干膏得率(Y4)為權重指標給予量化,根據1～9 級標度法對4 項指標進行兩兩比較,按9 分位比率評判各評價指標相對重要順序[24],確定各指標的先行順序為：山柰酚-3-O-蕓香糖苷>橙皮苷=川陳皮素>干膏率,指標判斷優先矩陣見表5。根據和積法計算得各指標的權重系數分別為0.2272,0.4231,0.2272,0.1225,隨機一致性比率CR=0.004<0.1,表明指標成對比較的判斷矩陣滿足一致性檢驗,權重系數有效。

表5 指標成對比較的判斷優先矩陣

2.2.3 正交試驗方法 按比例稱取處方中各藥材,共63 g,稱取9 份,按正交實驗表L9(34)安排的試驗方案[29-31]進行全方水提,濾過,合并兩次水提液,并將其濃縮至150 mL,每個正交試驗號平行3 次試驗。制備得到的樣品溶液,按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,分別測定正交供試品溶液中橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、川陳皮素的含量,分別取其平均值進行綜合評分。

2.2.4 干膏得率測定 精密吸取9 種工藝條件下水煎液50 mL,水浴蒸干,置105 ℃烘箱中干燥至恒重,按下式計算干膏得率：

干膏得率(%)=(50 mL濃縮液中固形物質量/50 mL×定容體積mL)/生藥材重量×100%

2.2.5 結果分析 實驗結果采用綜合評分法,根據層次分析法所得權重系數計算綜合評分。綜合評分=(Y1/Y1最大值)×0.2272+(Y2/Y2最大值)×0.4231+(Y3/Y3最大值)×0.2272+(Y4/Y4最大值)×0.1225。實驗結果見表6,直觀分析結果見表7,方差分析結果見表8。

表6 水提工藝正交試驗結果

表7 直觀分析結果

表8 方差分析

由表7直觀分析可知,以橙皮苷、川陳皮素、干膏得率為指標,煎煮次數(D)為主要影響因素;以山柰酚-3-O-蕓香糖苷為指標,各因素的作用為C>D>B>A,工藝組合為A1B2C1D2;對于綜合評分,各因素作用為D>C>B>A,工藝組合為A1B2C2D2。分別以極值最小的因素為誤差項進行方差分析,結果顯示：對于橙皮苷和干膏得率,D因素有顯著影響;對于川陳皮素,C、D因素均有顯著性影響;對于山柰酚-3-O-蕓香糖苷和綜合評分,各因素均無顯著影響。結合直觀分析結果和生產成本考慮,最終選取A1B2C2D2條件為最佳水提工藝,即藥材飲片不浸泡,加8 倍量水,煎煮2 次,每次2 h。

2.3 驗證試驗 按照處方比例稱取3份藥材63 g,按照確定的最佳提取工藝進行驗證試驗,測定結果見表9。

表9 驗證試驗結果

3 討論

消疳健胃湯原為藥材水煎劑,在臨床上已取得較好療效。消疳健胃合劑的制備選用水作為提取溶劑,能最大程度保留原方的煎藥方式,降低物質基礎發生變化的隱患[32]。

通過文獻查閱、對照品比對以及陰性溶液專屬性考察發現,山柰酚-3-O-蕓香糖苷為方中食涼茶特有,橙皮苷、川陳皮素為陳皮所特有,專屬性良好且含量相對較高。通過二極管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內掃描后發現在230 nm波長處3 個成分指標均有較大吸收,且基線穩定、分離度良好。因此選取230 nm作為試驗檢測波長。

傳統中藥復方組分復雜,作用機制不明確,僅采用單一成分作為評價指標缺乏全面性[33]。本文以方中君臣藥的主要化學成分為測定指標,同時結合層次分析法建立判斷矩陣可將各指標間的相互聯系轉為可量化的權重系數,使綜合評價更具科學性。

水提是中藥合劑的重要工藝單元,其加水倍數、提取時間和提取次數對處方有效成分的保留和制劑具有重要意義。針對橙皮苷、川陳皮素、干膏率指標而言,加水量為10 倍、提取次數為3 次評分效果最好,然而以山柰酚-3-O-蕓香糖苷和綜合評分指標而言,加水量為8 倍、提取次數為2 次效果最好,考慮到正交結果未發現顯著性差異,且加水量、提取次數減少可以節約成本和效能,另外,在臨床實際煎煮中,也是以煎煮2 次為最佳,因此最終選擇加水量為8 倍、提取次數為2 次。

本文采用層次分析法結合多指標綜合評價,對消疳健胃合劑的最佳水提工藝進行了考察,為消疳健胃合劑的進一步開發研究和臨床應用提供了參考依據。