麥角硫因抑制紫外輻射誘發自由基的試驗研究

孫 赫，王麗麗，康傳利，廉少杰，陳建英

（1.山東省藥學科學院 山東省皮膚與黏膜給藥工程技術研究中心，山東 濟南 250101；2.山東省藥學科學院 新型緩控釋制劑與藥物靶向遞送系統山東省工程研究中心，山東 濟南 250101；3.國家藥監局藥物制劑技術研究與評價重點實驗室，山東 濟南 250101；4.山東百阜福瑞達制藥有限公司，山東 濟寧 273100；5.山東福瑞達醫藥集團有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術重點實驗室，山東 濟南 250101）

1909年Charles Tanret從麥角菌（Claviceps purpurea）中分離出含硫晶體化合物，并命名為麥角硫因（ergothioneine，EGT）。EGT作為一種天然手性氨基酸衍生物，存在硫醇和硫酮兩種互變異構形式，在人體內主要以硫酮形式存在[1]。與烷基硫醇谷胱甘肽（RSH）不同，這種咪唑硫酮結構在溶液中不會自氧化，也不會在鐵鹽和氫過氧化物存在下誘導芬頓反應[2]。研究表明EGT可抑制脂質過氧化損傷[3]，清除羥自由基（·OH）[4]、超氧化物和單線態氧（1O2）等多種活性氧（ROS）物質，是優異的皮膚光敏保護劑[5-7]。人體內的EGT并不是由人體本身合成，而是由放線菌、分枝桿菌等微生物合成后，通過植物吸收和食物鏈傳遞至人體內積累而存在的。

皮膚衰老是機體衰老最直接的表現，除自然衰老等內部因素外，引起皮膚衰老的還有諸如自然環境、外傷、接觸某些化學物質等外界因素，其中最重要的是日曬，即光老化。陽光中的紫外輻射照射到人體表皮細胞后可產生1O2、·OH等有害物質，誘發DNA、蛋白質和細胞組織的損傷，并表現為皮膚的衰老和損傷。本文通過紫外線照射光敏劑羅丹明B（RhB）溶液誘發包括1O2在內的自由基體系（下文簡稱UV-RhB體系）[8-10]，模擬紫外線照射人體皮膚產生ROS的情況，研究EGT在此體系下的抗氧化性能及其穩定性，以期為EGT應用于抗衰護膚品的開發提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Infinite M200PRO 酶標儀（Tecan）；MS204TS/02 電子天平（Mettler Toledo）；SCIENTZ 03-II 紫外交聯儀（新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

EGT（化妝品級，批號：220308，山東百阜福瑞達制藥有限公司）；維生素C（藥用級，東北制藥集團股份有限公司）；羅丹明B及其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 UV-RhB體系中EGT和VC抗氧化性能的測定

以pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS，取2.2 g Na2HPO4，0.3 g NaH2PO4和8.5 g NaCl，加水溶解至1000 ml）為溶劑，分別配制0.001 %羅丹明B溶液（RhB）、0～1.00 mg/ml的EGT溶液及維生素C（VC）溶液。按表1配制測定溶液體系I、II，置紫外光（波長254 nm，光強度5 mW/cm2）下照射。分別于0，1 h時，采用酶標儀，測定555 nm波長處吸收值（A0和A1），每個樣品平行3份，計算0 h和1 h吸光度變化量的平均值（ΔA），以ΔA空白為基線，按下式計算體系中活性物質的抗氧化性能（F）。

表1 抗氧化作用測定溶液體系

式中，ΔA空白：空白對照溶液的吸收值的變化量（A0空白-A1空白）；ΔA樣品：樣品溶液的吸收值的變化量（A0樣品-A1樣品）。

2.2 離子強度對EGT抗氧化性能的影響

按表1配制測定溶液體系III，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，以EGT濃度為0的體系作為空白對照，分別加入NaCl濃度分別為0 %，0.40 %，0.85 %，1.30 %，1.75 %的PBS。按2.1項下方法平行測定3份，取其平均值，計算不同離子強度體系的ΔA和F值。

2.3 pH值對EGT抗氧化性能的影響

按表1配制測定溶液體系IV，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，以EGT濃度為0的體系作為空白對照，用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液分別調節PBS緩沖液pH值為3.0，5.0，7.2，9.0，11.0。按2.1項下方法平行測定3份，取其平均值，計算不同pH體系的ΔA和F值。

2.4 還原劑對EGT抗氧化性能的影響

按表1配制測定溶液體系V，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，并以EGT濃度為0的體系作為空白對照，Na2SO3溶液以PBS緩沖液為溶劑，濃度分別為0 %，0.02 %，0.05 %，0.10 %，0.25 %，0.50 %。按2.1項下方法平行測定3份，取其平均值，計算不同還原劑濃度體系的ΔA和F值。

2.5 金屬離子對EGT抗氧化性能的影響

按表1配制測定溶液體系VI，其中溶劑為生理鹽水，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，并以EGT濃度為0的體系作為空白對照。分別加入0.05 mol/L的K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+生理鹽水溶液。按2.1項下方法平行測定3份，取其平均值，計算不同金屬離子體系的ΔA和F值。

2.6 EDTA對EGT抗氧化性能的影響

按表1配制測定溶液體系VII，其中溶劑為生理鹽水，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，并以EGT濃度為0的體系作為空白對照。分別加入0.10 mol/L的Fe3+溶液和0 %，0.02 %，0.04 %，0.10 %，0.20 %的EDTA溶液。按2.1項下方法平行測定3份，取其平均值，計算不同EDTA濃度體系的ΔA和F值。

3 結果與分析

3.1 EGT和VC的抗氧化量效關系

不同濃度EGT和VC的抗氧化性能見圖1。由圖1可見，0～1 mg/ml范圍內，EGT和VC的F值隨濃度的升高而增大，且相同濃度下EGT的F值一直高于VC，表明EGT和VC抗氧化作用具有較好的量效關系，同時在此體系下EGT的抗氧化性能優于VC。

圖1 不同濃度EGT和VC的抗氧化性能

3.2 離子強度對EGT抗氧化性能的影響

離子強度對EGT抗氧化性能的影響見圖2。由圖2可見，NaCl濃度在0 %～0.85 %范圍內，EGT的F值較為穩定，當NaCl濃度高于0.85 %時，F值急劇下降，表明此時EGT抗氧化性能受到體系內高離子強度的抑制而顯著降低。

圖2 離子強度對EGT抗氧化性能的影響

3.3 pH值對EGT抗氧化性能的影響

pH值對EGT抗氧化性能的影響見圖3。由圖3可見，在pH 5～9范圍內EGT的F值變化相對較小，表明EGT抗氧化活性在pH 5～9范圍內較為穩定。

圖3 pH值對EGT抗氧化能力的影響

3.4 還原劑對EGT抗氧化性能的影響

還原劑亞硫酸鈉對EGT抗氧化性能的影響見圖4。由圖4可見，隨著亞硫酸鈉濃度的增大，F值呈下降趨勢，表明在此體系中加入亞硫酸鈉可抑制EGT的抗氧化活性。亞硫酸鈉濃度大于0.1 %時，F值趨于穩定，表明其抑制作用趨于平緩。

圖4 亞硫酸鈉對EGT抗氧化性能的影響

3.5 金屬離子對EGT抗氧化性能的影響

不同金屬離子對UV-RhB體系的影響見圖5A。結果顯示，與Na+體系相比，K+、Mg2+、Zn2+體系中ΔA空白變化較小，表明加入這3種離子對體系內RhB的降解速率影響較??；Cu2+對RhB的降解速率有較明顯的抑制，而加入Fe3+后，體系中RhB降解速率顯著提高，分析原因為Fe3+在水中形成Fe(OH)2+，經光照射生成Fe2+和羥自由基[11-13]，增大了體系內自由基的濃度，進一步加劇了RhB的降解。

圖5 不同金屬離子對UV-RhB體系及EGT抗氧化性能的影響

不同金屬離子對EGT抗氧化性能的影響見圖5B。結果顯示，與Na+體系相比，Zn2+對EGT抗氧化性能沒有明顯影響，K+、Mg2+對EGT的抗氧化作用有一定程度的抑制，Cu2+在抑制RhB降解的同時對EGT的抗氧化性能也有較為明顯的抑制作用。而在體系中加入Fe3+，RhB降解速率提高的同時，EGT的抗氧化性能也得到了明顯的提升，這也表明EGT可有效抑制Fe3+誘發的氧化應激反應。

3.6 EDTA對EGT抗氧化性能的影響

EDTA對EGT抗氧化性能的影響見圖6。由圖6可見，在添加Fe3+的體系中，EGT抗氧化性能隨EDTA的濃度增加而減小，分析原因為EDTA與Fe3+形成金屬絡合物后降低了體系內Fe3+的濃度，削弱了Fe3+對UV-RhB體系和EGT抗氧化性能的影響。

圖6 EDTA對EGT抗氧化性能的影響

4 結論

光老化、氧化自由基和皮膚糖化被認為是皮膚衰老的直接原因。其中，紫外照射皮膚后能產生1O2、脂質自由基、脂質過氧化物（LPO）等物質，降低皮膚細胞抗氧化防御能力，導致膠原蛋白酶和彈性蛋白酶的釋放，并破壞兩種蛋白質和結締組織，造成皮膚衰老、損傷等多種問題。本文通過建立紫外輻射光敏劑誘發自由基體系，測定抗氧化活性物質的抗氧化性能。在此體系下EGT表現出優異的抗氧化性能，且在低離子強度和pH 5～9范圍內具有良好的穩定性。