流池法測定纈沙坦片溶出度的方法學研究

甘加明，黃 丹，嚴全鴻

（廣東省藥品檢驗所，國家藥品監督管理局藥品快速檢驗技術重點實驗室，廣東 廣州 510663）

纈沙坦（valsartan，VAL），化學名稱為N-戊?；?N-[[2’-（1H-四氮唑-5-基）聯苯-4-基]甲基]-L-纈氨酸，屬于第二代血管緊張素II受體抑制劑抗高血壓類藥物，它選擇性地作用于1型受體，阻斷血管緊張素II與1型受體的結合，從而抑制血管收縮和醛固酮的釋放，產生降壓作用。有文獻報道[1-3]，纈沙坦能有效治療輕、中度原發性高血壓，并能改善患者的胰島素抵抗，并且不作用于血管緊張素轉換酶（ACE）、腎素和其他受體，不抑制與血壓調節和鈉平衡有關的離子通道，不良反應少。纈沙坦屬于BCS II類（低溶解高滲透）藥物[4]，在水中幾乎不溶，為pH依賴型藥物，隨pH值上升，溶解度增加[5]。藥物自身溶解度和藥物從制劑內釋放的速率決定了藥物的溶出度，直接影響制劑的質量和療效[6-7]。體外溶出試驗是評價口服固體制劑內在質量的一種重要手段，也是口服固體制劑開發和質量控制中的重要方法?！吨袊幍洹?020年版四部通則新增流池法（flow-through cell method，FTC）[8]作為溶出度與釋放度測定的第六法。FTC不僅適用于片劑和膠囊劑等傳統口服固體制劑的溶出度測定，還可用于粉末、栓劑、顆粒劑、混懸劑、微球等劑型及藥物洗脫支架的溶出度測定。流池法可避免已有溶出度測定方法因吸附平衡導致的溶出困難及機械攪拌的弊端，尤其適用于難溶性藥物的溶出研究，能更好地模擬體內生理環境，更具有區分力[9]。

《中國藥典》2020年版中纈沙坦片質量標準經修訂后的公示稿[10]、美國藥典43版、日本藥局方2018版和英國藥典2022版纈沙坦片的溶出度檢查均采用第二法（槳法），轉速為每分鐘50轉，以pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質，在該溶出條件下15 min內纈沙坦片即達到全溶出。該溶出方法既不能精確地控制藥物釋放速率，也無法起到控制產品質量的作用。本文建立了一種具有合適區分力的體外溶出方法，該方法對纈沙坦片的處方優化和質量評價具有重要參考價值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SOTAX CE7 Offline流通池溶出度儀，包括SOTAX CE7主機、CY7-50活塞泵（瑞士Sotax公司）；SHIMADZU高效液相色譜儀（紫外檢測器，日本島津公司）；SOTAX AT 7X溶出度儀（瑞士Sotax公司）；Mettler XS205電子分析天平（美國Mettler Toledo公司）；Sartorius PB-10 pH計（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

纈沙坦片（規格：80 mg；來源：A公司，批號：12100；B公司，批號：20200502）；纈沙坦對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100651-202006，含量： 99.0 %）；鹽酸，磷酸二氫鉀，冰醋酸，氫氧化鈉，乙酸鈉均為分析純，乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：SHISEIDO SPOLAR C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水-冰醋酸（500:500:1）為流動相，檢測波長為230 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 ml/min，進樣量為10 μl。

2.2 方法學驗證

2.2.1 溶液制備

2.2.1.1 對照品溶液 取纈沙坦對照品約10 mg，精密稱定，置入50 ml量瓶，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取4 ml，置入10 ml量瓶，用pH 6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，即得。

2.2.1.2 供試品溶液 取供試品粉末適量（相當于纈沙坦約10 mg），精密稱定，置入25 ml量瓶并加入pH 6.8磷酸鹽緩沖液10 ml，超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取續濾液2 ml，置入10 ml量瓶，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.1.3 空白輔料溶液 按處方取不含纈沙坦的空白輔料約10 mg，置25 ml量瓶中，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液10 ml超聲，稀釋至刻度，搖勻，精密量取續濾液2 ml，置10 ml量瓶中，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 專屬性試驗 分別取空白輔料溶液、供試品溶液和對照品溶液，按2.1項下色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖1。結果顯示，空白輔料和溶出介質均不干擾纈沙坦的含量測定。

圖1 專屬性試驗HPLC圖譜

2.2.3 線性試驗 取纈沙坦對照品約31.47 mg，精密稱定，置入20 ml量瓶，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液5 ml，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。分別取對照品貯備液適量，用pH 6.8磷酸鹽緩沖液定量稀釋制成約含纈沙坦0.8，3.9，7.8，15.7，62.9，125.9，629.4，786.7，1258.9 μg/ml的系列溶液，按 2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以峰面積（Y）對濃度（X，μg/ml）進行線性回歸，結果表明纈沙坦在0.8～1258.9 μg/ml濃度范圍內線性關系良好（r=0.999），線性回歸方程為Y=16 454X+87 154。

2.2.4 加樣回收試驗 取處方量空白輔料9份，共分為3組，分別置25 ml量瓶中，每組分別加入纈沙坦對照品8，10，12 mg，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋刻度，搖勻，濾過，精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，用pH 6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，分別作為低、中、高濃度溶液。取低、中、高濃度溶液按 2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果表明高、中、低3個濃度平均回收率為100.8 %（n=9），RSD=0.8 %，表明方法的準確度良好。

2.2.5 重復性試驗 取樣品（B 公司，批號：20200502）6份，按2.2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，平均含量為99.4 %，RSD=0.6 %（n=6），表明方法重復性符合要求。

2.2.6 精密度試驗 取對照品溶液，連續進樣6次，纈沙坦峰面積RSD=0.1 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 將供試品溶液于進樣器內室溫下放置，分別于0，2，4，6，8，10，12 h，按 2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，纈沙坦峰面積RSD為0.1 % ，結果表明供試品溶液在12 h內穩定。

綜上，擬定分析方法滿足定量分析要求。

2.3 濾膜吸附試驗

取供試品（B公司，批號：20200502），按2.2.1.2項下方法制備供試品溶液，5000 r/min離心5 min，取上清，按2.1項下色譜條件注入液相色譜儀，記錄峰面積；另取供試品（B公司，批號：20200502），按2.2.1.2項下方法制備供試品溶液，先后經0.27 μm Whatman GF/D、0.7 μm GF/F玻璃纖維濾膜濾過，取續濾液，按2.1項下色譜條件注入液相色譜儀，記錄峰面積。結果表明兩種方式處理的供試品溶液色譜圖中纈沙坦峰面積無顯著差異，表明濾膜無吸附。結果見表1。

表1 濾膜吸附考察結果

2.4 溶出介質的選擇

2.4.1 溶出介質的制備 pH 1.2鹽酸溶液：取鹽酸7.65 ml，加水稀釋至1000 ml，搖勻，即得；pH 4.5醋酸鈉緩沖液：取醋酸鈉2.99 g與2 mol/L醋酸溶液14.0 ml，加水稀釋至1000 ml，搖勻，即得；pH 6.8磷酸鹽緩沖液：取0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液250 ml與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液混合后，加水稀釋1000 ml，搖勻，即得；水：純化水。

2.4.2 溶出度測定 采用流池法開放系統，將纈沙坦片置于錐形部裝滿1 mm玻璃珠的直徑22.6 mm流通池內，分別采用pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH6.8磷酸鹽緩沖液、水為溶出介質，溫度為 37±0.5 ℃，流速為4 ml/min，收集0～5、5～10、10～15、15～20、20～30、30～45、45～60、60～90 min時間段的溶出液（溶出液已在線通過0.7 μm、0.27 μm的玻璃纖維濾膜），取溶出液，按2.1項下色譜條件進行測定，按外標法以峰面積計算各時間點的累積溶出量，結果見圖2。由圖2可知，上述4種溶出介質中，纈沙坦片的溶出行為差異較大，溶出量隨溶出介質pH值的升高而增加，為典型的pH依賴型藥物；纈沙坦片在以pH 1.2鹽酸溶液為溶出介質時90 min內的累積溶出量僅為2.6 %，溶出程度和溶出速率均最小，以水和pH 4.5醋酸鹽緩沖液為溶出介質時，90 min內的累積溶出量分別為24.8 %，43.3 %，均未達溶出平臺且累積溶出量均小于85 %，溶出程度和溶出速率均較小，而以pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質時，45 min時達到溶出平臺且累積溶出量為97.9 %，隨著溶出時間的延長，溶出速率先不斷增大，后緩慢減小，溶出曲線無拐點。結合各國藥典中纈沙坦片溶出度檢查項均選用pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質，故本文選擇pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質。

圖2 不同溶出介質的溶出曲線（流速為4 ml/min）

2.5 流池法測定溶出度的影響因素

2.5.1 溶出介質的流速 一般情況下，溶出介質的流速對于藥物的溶出速率的影響是比較明顯的?！吨袊幍洹?020年版四部0931溶出度與釋放度測定法中流池法的標準流速為4，8，16 ml/min[8]，本文以pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質，分別考察3種標準流速對纈沙坦片溶出曲線的影響。結果見圖3。由圖3可見，隨著流速的提高，溶出速率也會隨之提高，達到溶出平臺時間減少，其中溶出介質流速為4 ml/min時溶出速率最低，達到溶出平臺時間最長，溶出介質流速為16 ml/min時較流速為8 ml/min溶出速率略微提高。本文選取溶出介質的流速為4 ml/min進行實驗。

圖3 不同流速下的溶出曲線（溶出介質為pH 6.8磷酸鹽緩沖液）

2.5.2 流通池內徑的影響 標準流通池的內徑一般為12 mm和22.6 mm，在流池法試驗中小規格制劑采用小型流通池可提高低濃度取樣分析的靈敏度，且崩解后的顆粒會均勻地分布在表面[11]。本研究選用了兩種內徑的流通池，以pH 6.8緩沖液為溶出介質，流速為4 ml/min進行實驗，以全面分析纈沙坦片的溶出情況，結果見圖4。圖4結果顯示，在內徑12 mm的流通池內，纈沙坦片的溶出速率較快，故本文采用內徑為22.6 mm流通池進行后續研究。

圖4 不同內徑的流通池溶出曲線

2.6 溶出度測定

分別采用新建立的流池法與《中國藥典》2020年版纈沙坦片質量標準中溶出度檢查法[12]（槳法，轉速50 r/min，溶出介質為pH 6.8磷酸鹽緩沖液1000 ml，取樣時間點為5，10，15，20，30，45，60 min）對兩家公司的纈沙坦片的溶出度進行測定，計算累積溶出度，結果見表2。結果表明，纈沙坦片在槳法和流池法中溶出曲線有明顯差異，槳法裝置下，累積溶出量在15 min內均達85 %以上，且處于溶出平臺；流池法測定的溶出曲線緩慢上升，且溶出曲線無拐點和突釋，在45 min后處于溶出平臺，累積溶出量達85 %以上。

表2 兩家公司的纈沙坦片累積溶出量（槳法和流池法）

2.7 溶出曲線比較

2.7.1 非模型依賴的相似因子法比較 根據《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》[13]，當受試制劑與參比制劑在15 min內的累積溶出量不低于85 %，可認為兩者溶出行為相似，故采用槳法測定A、B兩家公司的纈沙坦片的溶出曲線相似；采用非模型依賴相似因子法對A、B兩家公司的流池法測得得纈沙坦溶出曲線進行相似性評價，其相似因子f2值為69（選取前5個時間點的累積溶出量計算），非模型依賴相似因子f2值高于50 時，可認為兩條曲線具有相似性，故兩家公司的纈沙坦片溶出曲線相似。

2.7.2 模型依賴的參數比較 采用DDsolver軟件中的零級、一級、Higuchi、Weibull和Peppas-Sahlin模型對數據進行擬合，結果零級、Higuchi和Peppas-Sahlin模型擬合效果不佳（r＜0.99），Weibull和一級模型擬合效果較好，且 Weibull模型（r＞0.998）擬合效果優于一級模型（r＞0.991），故選定Weibull模型對流池法測定的溶出曲線數據進行擬合，得到特征溶出參數T50和Td（藥物溶出50 %和63.2 %所需時間），結果見表3。采用SPSS17.0軟件分別對兩公司樣品的T50和Td進行t檢驗，結果顯示，兩樣品的溶出參數差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 Weibull擬合特征溶出參數

3 討論

3.1 檢測方法的選擇

國內外現行藥典均使用UV法測定纈沙坦片的溶出度，且各國藥典僅測定30 min時的溶出度，溶出液濃度范圍變化小，而采用流池法測定纈沙坦片溶出度，其溶出液濃度變化范圍大。故本文擬參考《中國藥典》2020年纈沙坦片含量測定項下的色譜條件，根據實際測定情況，建立了纈沙坦片溶出度測定的HPLC法，該方法經方法驗證，各項結果均滿足要求。本方法操作簡便，可用于纈沙坦片溶出度的測定。

3.2 溶出介質的選擇

根據《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》推薦的各種不同pH溶出介質，結合國內外現行藥典選用的溶出介質，本文選用pH 6.8磷酸鹽緩沖液作為溶出介質，與各國藥典一致。

3.3 溶出介質流動方式

流池法的樣品池中可加入玻璃珠，一般認為不加玻璃珠為湍流，加入玻璃珠為層流[14-16]。謝莉等[17]的研究指出僅以玻璃珠的加入與否來斷定流體為層流或湍流是不全面的，但加入玻璃珠可降低流體的可變性。本文采用加入玻璃珠方式。

3.4 金屬片夾（V字型）

一般情況下，樣品自由放置或使用金屬片夾（V字型）固定在玻璃床上部的一定位置上[18]。本文采用將樣品自由放置在玻璃珠上。

4 小結

本文通過流池法測定纈沙坦片溶出曲線，分別采用非模型依賴的相似因子（f2）法和Weibull模型評價體外溶出曲線。纈沙坦片在溶出初始階段溶出速率較快，即溶出量隨時間快速增加，隨后溶出速率逐漸減慢，并逐漸進入全溶階段。流池法能提供較為溫和的溶出環境，有助于藥物研發階段中的處方篩選、工藝優化和質量控制；能更好地模擬體內壞境，有助于評估藥物的體內溶出和釋放特性。