基于網絡藥理學探討長春新堿治療乳腺癌的作用機制

劉遠亭，韓淑萍，劉 沙，楊證玉，何俊超，張燕琴*

（1.成都醫學院 藥學院，四川 成都 610500；2.中國人民解放軍空軍第986醫院，陜西 西安 710054）

目前，乳腺癌不僅是最常見的惡性腫瘤之一，也是引起女性死亡的第二大癌癥[1-2]，嚴重威脅女性的身心健康，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。據我國流行病學資料顯示：我國的女性惡性腫瘤中，乳腺癌早期患者的生存率顯著高于晚期患者[3]，乳腺癌早期癥狀不明顯，確診后多數患者已處于疾病晚期[3-4]。因此治療乳腺癌的核心是早診斷和早治療。研究表明從雙子葉綱、龍膽目、夾竹桃科長春花中提取的雙吲哚型生物堿──長春新堿[5]（圖1），為應用最廣的天然植物抗癌藥物，具有治療乳腺癌、惡性淋巴瘤和小細胞肺癌等疾病的作用[6]。乳腺癌發病機制繁瑣且復雜。本研究以乳腺癌為研究對象，基于網絡藥理學方法，選用生物信息學結合蛋白互作網絡拓撲分析手段，預測長春新堿治療乳腺癌的關鍵作用靶點，研究其可能的作用機制，為長春新堿治療乳腺癌提供理論基礎。研究流程見圖2。

圖1 長春新堿結構

圖2 長春新堿治療乳腺癌作用機制的研究流程

1 儀器與材料

1.1 儀器

電泳儀（美國BIO RAD）；凝膠成像儀（美國BIO RAD）；酶標儀（中國成都錦世昌祥科技有限公司）；生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific）；細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific）；臺式冷凍離心機（德國Eppendorf）；移液器（德國Eppendorf）。

1.2 細胞和試藥

MCF-7乳腺癌細胞（中國科學院上海細胞庫）；長春新堿（成都藝萌科技有限公司）。

1.3 軟件

Image JV1.8.0（正式版）軟件；Grapd Prism 8.3。

2 方法

2.1 長春新堿相應靶點基因的收集與整理

查詢藥物長春新堿英文名稱，登錄pubchem服務器（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），查詢并下載藥物的2D分子結構式（圖1），并儲存為“.sdf”格式，然后將sdf文件上傳至SwissTargetPrediction數據庫（http://swisstargetprediction.ch/）進行分子與靶蛋白對接。利用uniport數據庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）將uniport ID轉化成Gene symbol，收集并整理長春新堿所有的靶點基因，刪除重復值。上傳靶點基因于STRING 11.0網站，將系統參數設置為最低相互作用評分>0.4[7]，去除無關聯靶點且選擇物種為人，獲得蛋白-蛋白相互作用網絡（PPI）圖，并導出靶點蛋白互作關系表。

2.2 長春新堿-蛋白靶點互作網絡圖的繪制

利用網絡圖像化軟件Cytoscape 3.7.2繪制長春新堿-蛋白靶點互作網絡圖[8]。其中長春新堿與靶蛋白用“節點”表示，而長春新堿與靶點之間的關系、靶點與靶點之間的關系用“邊”表示。

2.3 乳腺癌已知靶點的檢索及疾病蛋白PPI的繪制

本研究對乳腺癌靶點的檢索采用的是疾病數據庫──OMIM數據庫，查詢到疾病乳腺癌的準確英文名稱為“Breast Carcinoma”，并將其作為關鍵詞進行檢索，以獲得疾病靶點，去重后保留剩余靶點。將靶點蛋白上傳于STRING 11.0網站[7]，設置最低相互作用評分>0.4，去除無關聯靶點且選擇物種為人，得到PPI圖，導出靶點蛋白互作關系表。

2.4 藥物-疾病蛋白互作網絡圖的繪制和藥物-疾病關鍵靶點篩選

藥物-疾病蛋白互作網絡圖的繪制主要采用Cytoscape軟件中的BisoGenet插件，將1.1項下獲得的長春新堿作用靶點和1.3項下獲得的乳腺癌已知靶點在BisoGenet插件中分別繪制出各自的PPI圖，并合并二者PPI圖，獲得長春新堿-乳腺癌的交集網絡。利用網絡拓撲分析插件CytoNCA篩選出長春新堿-乳腺癌交集網絡中網絡靶標（Degree）大于中位數2倍的節點[9]，得到交集網絡中的關鍵節點，再通過篩選以下幾個指標如中介中心性（Betweenness），接近中心性（Closeness），特征向量（Eigenvector），網絡（Network）及局部邊連通性（Local average connectivity，LAC），最終得到其關鍵基因[10]。獲得的關鍵基因可能解釋長春新堿治療乳腺癌的直接或間接作用機制。

2.5 關鍵基因靶點網絡的構建

利用STRING 11.0網絡平臺，將2.4項下篩選的關鍵靶點蛋白進行PPI圖的構建，設置最低相互作用評分>0.4，去除無關聯靶點且選擇物種為人，得到靶點蛋白互作關系，運用 Cytoscape 3.7.2 軟件進行繪圖和分析，網絡靶標（Degree）大小可通過設置節點的顏色和大小來反映，連接評分（Combine score）的大小可通過設置邊的顏色和大小來反映，獲得最終的PPI圖，合理布局并調整獲得的PPI圖像。

2.6 功能富集分析和通路富集分析

利用軟件Cytoscape中的ClueGO分析插件[11]，將2.4項下篩選的關鍵靶點蛋白分別進行功能富集及通路富集分析，并根據其重要程度繪制出占比餅狀圖和簇狀條形圖；其中富集分析的結果可通過節點的形式在ClueGO插件中展現，充分發揮其圖像化功能。同時采用同一種顏色的節點來表示同一類型的功能蛋白，而基因功能的顯著性通過節點大小來體現，若該基因功能上的節點越大，表明基因功能的顯著性越高，重要性也越強。

2.7 細胞培養及Western blot分析

凍存的MCF-7細胞37 ℃水浴解凍。細胞1000 r/min離心5 min后培養于含10 %小牛血清和1 %雙抗的高糖培養基中，并置于37 ℃、5 % CO2培養箱中培養，每2 d換液一次，細胞密度達80 %左右開展實驗。采用不同濃度（50，100，200 nmol/L）的長春新堿處理細胞[12]，給藥1 d后提取細胞蛋白，常規SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育2 h后使用凝膠成像儀檢測灰度值，并利用Image JV1.8.0（正式版）軟件統計分析長春新堿對核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin-1，NPM1），DHX9，真核翻譯延伸因子 1（EEF1A）及HSP90表達的影響。

2.8 統計分析

用Grapd Prism 8.3軟件統計數據并做柱狀圖。組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表明具有統計學意義。

3 結果

3.1 長春新堿的靶點

通過SwissTargetPrediction數據庫獲得107個與長春新堿相關的預測靶點，見圖3，其中G蛋白偶聯受體（Family A G protein-coupled receptor）、蛋白酶（protease）、細胞色素P450（Cytochrome P450）等占比較大。

圖3 目標蛋白概率圖

3.2 長春新堿-蛋白靶點-蛋白靶點互作網絡圖的繪制和分析

結果見圖4。由圖4可見，互作網絡圖共存在108個節點和801個關系。通過對應關系的數目和復雜程度，體現了長春新堿具有多靶點屬性，且蛋白靶點之間相關性較高。

圖4 長春新堿-蛋白靶點互作網絡圖

3.3 乳腺癌相關基因分析和檢索

結果見圖5。由如圖5可見，使用疾病基因數據庫──OMIM最終得到506個相關靶點，表明疾病的靶點蛋白之間具有高度相關性。

圖5 乳腺癌的靶點蛋白互作關系網絡圖

3.4 藥物-疾病蛋白互作網絡圖的繪制及關鍵靶點的篩選

3.4.1 長春新堿治療乳腺癌的蛋白互作網絡圖 長春新堿的靶點蛋白互作網絡中有4067個靶點與長春新堿存在直接或間接作用，靶點與靶點之間存在115 447種聯系。乳腺癌的靶點蛋白互作網絡圖表明有5619個靶點與乳腺癌存在直接或間接作用，靶點與靶點的相互關系達141 283種。重合二者以上的網絡圖取交集網絡，獲得藥物-疾病蛋白互作網絡圖6。如圖6所示，共得到3274個節點和86 930種關系。

圖6 長春新堿-乳腺癌蛋白靶點互作交集網絡圖

3.4.2 長春新堿-乳腺癌關鍵靶點的篩選 結果見圖7。由圖7可見，采用Cytoscape中的分析插件CytoNCA篩選出Degree大于中位數2倍的節點，即Degree>66，獲得814個節點和34 869條邊的黃色圖，再通過篩選以下幾個指標大于中位數的節點，即Betweenness>345.76，Closeness>0.518，Degree>107，Eigenvector>0.023，Network>20.158，LAC>18.497，獲得262個節點和10 088條邊的紅色圖，再繼續篩選大于中位數的節點，即Betweenness>989.16，Closeness>0.541，Degree>174，Eigenvector>0.047，Network>29.726，LAC>39.159，獲得70個節點和1246條邊的最終關鍵靶點互作圖。

圖7 關鍵靶點篩選圖

3.5 長春新堿-乳腺癌關鍵蛋白互作網絡圖的繪制與分析

將以上篩選的70個關鍵基因導入STRING 11.0網絡平臺，分析后獲得關鍵基因互作網絡圖，見圖8。如圖8所示，關鍵蛋白利用節點表示，蛋白之間的關聯采用邊表示，其靶點蛋白Degree的值利用節點大小表示，節點越大表明該靶點蛋白的Degree值越大，體現該節點在網絡中的重要性越高。靶點蛋白之間的連接評分（combine score）值大小用邊的粗細反映，邊越粗表明靶點蛋白之間combine score值越大，蛋白間的直接相關性也越強。該網絡圖共表達網絡節點數70個，表明有70個關鍵靶點蛋白，靶點蛋白之間的相互聯系達525種，且關鍵靶蛋白之間有強烈的相關性。關鍵靶點基因及蛋白見表1。

圖8 關鍵基因互作網絡圖

3.6 藥物-疾病關鍵靶點富集分析

3.6.1 功能富集分析 對以上70個靶點蛋白進行功能富集分析，結果見圖9、圖10。由圖9、圖10可見，生物過程中富集較為集中的為：白介素7（IL-7）介導的信號通路、mRNA穩定性的調控、蛋白質-DNA復合物、蛋白質定位于線粒體的正向調控等；分子功能富集較為集中的為：泛素蛋白連接酶、細胞對淀粉樣蛋白的反應等，而對于細胞組分無關鍵特征功能。

圖9 GO富集分析圖

圖10 Cluego-GO富集網絡圖

3.6.2 通路富集分析 利用Cytoscape中的ClueGO 插件將70個關鍵靶點進行通路富集分析。其中P<0.05的生物通路共有13條，通路富集分析的結果在ClueGO插件中以節點的形式展現，節點大小顯示信號通路的顯著性，節點越大，該通路的重要性越高，見圖11、圖12。由圖11、圖12可見，長春新堿治療乳腺癌的機制主要與癌癥轉錄失調，細胞周期，抗原處理和遞呈，軍團菌病，泛素介導的蛋白水解作用，剪切體，DNA復制等信號通路有關，表明長春新堿具有作用途徑廣的特點。

圖11 KEGG富集分析圖

圖12 ClueGO-KEGG富集簇狀圖

3.7 長春新堿下調NPM1，DHX9，EEF1A及HSP90蛋白表達

結果見圖13。由圖13 可見，與正常組比較，用200 nmol/L濃度的長春新堿處理細胞后，NMP1，DHX9，EEF1A及HSP90蛋白表達均下調（P<0.05），100 nmol/L濃度長春新堿處理組僅NMP1及DHX9蛋白表達下調（P<0.05），50 nmol/L長春新堿處理細胞后NMP1，DHX9，EEF1A及HSP90蛋白表達無明顯變化（P>0.05）。

圖13 長春新堿對乳腺癌細胞MCF-7中NPM1，DHX9，EEF1A及HSP90蛋白表達的影響

4 討論

長春新堿通過干擾細胞微管蛋白代謝達到抗腫瘤作用。研究顯示，乳腺癌的增殖分化過程與多種因素相關，包括基因突變、基因表達及蛋白豐度的變化[12-14]。乳腺癌發病機制繁瑣且復雜，對其系統性的分析不足。長春新堿雖已報道可用于乳腺癌的治療，但針對長春新堿治療乳腺癌的具體靶點研究較少。因此本研究以長春新堿和乳腺癌為研究對象，基于網絡藥理學方法，預測長春新堿治療乳腺癌的關鍵作用靶點。

首先針對長春新堿繪制長春新堿-蛋白靶點的互作網絡圖及蛋白與蛋白之間的互作網絡圖，共獲得108個相關靶點與801個互作關系。以上結果表明，長春新堿具有多靶點效應且靶點之間存在協同互作關系，對于乳腺癌的病理進程可能發揮著不同作用，合并網絡圖后證明長春新堿確實具有治療乳腺癌的潛力。

其次從功能富集結果分析可知，IL-7在結果中占比較高。IL-7主要由樹突狀細胞、小腸上皮細胞、巨噬細胞、胸腺細胞和皮膚角化細胞等分泌[15-18]，參與機體多種生理及病理反應，維持著機體正常的免疫功能。IL-7可引起惡性腫瘤的發生和增殖，通過wortmannin敏感徑路引起乳腺癌細胞的生長繁殖[19]。故通過調控IL-7介導的信號通路可抑制乳腺癌的生命活動。mRNA也在結果中占據較高比例，可通過調控乳腺癌細胞的mRNA轉錄，轉運及翻譯等過程，參與到腫瘤的病理進程中，從而影響乳腺癌細胞中的蛋白質合成[20]。組織相容性復合物II（major histocompatibility complex class II，MHC II）類分子的主要作用是協調免疫細胞間的關系，長春新堿可調控細胞內的MHC II類分子，從而調節機體免疫功能以增強對乳腺癌的免疫效應[21]。

且從通路富集結果分析可知，首先影響乳腺癌生命活動的信號通路為細胞轉錄調控失調通路，此過程導致細胞轉錄發生時間無法控制，引起癌細胞的基因表達發生異常。長春新堿主要通過作用在轉錄失調的靶點，以緩解異?；虻谋磉_，從而影響乳腺癌異常的生命活動[22]。其次是癌細胞細胞周期的失控，細胞增殖失控是惡性腫瘤最重要的特征之一[23]，維持細胞周期的正常次序及內環境的穩定可防止惡性腫瘤形成[24]。再者乳腺癌易發生肺、骨和腦轉移[25-26]，且惡性腫瘤更易借助淋巴系統發生轉移[27]，故可通過增強抗原遞呈細胞的調控來加快乳腺癌細胞的滅活。泛素化介導的蛋白質降解對癌細胞的生長進程調控也具有重要影響，泛素介導蛋白質降解中的去泛素化生理過程，對癌癥治療有一定積極作用[28-29]。去泛素化是通過多步反應后將泛素小分子從目的蛋白上剝離，可通過去泛素化來抑制降解目標蛋白質，從而影響乳腺癌的發生和進展[30]。剪切體雖不會翻譯出任何蛋白，但其特異性表達的可變剪接產物，可通過參與乳腺癌的發生、激活侵襲和轉移等生理進程，對乳腺癌的發生和發展產生積極作用[31-32]。

長春新堿也具有通過調控DNA復制來影響乳腺癌細胞增殖和分化的作用。為進一步探討長春新堿治療乳腺癌的作用機制，采用不同濃度的長春新堿處理MCF-7后，檢測MCF-7中NPM1，DHX9，EEF1A及HSP90蛋白表達，均下調。NPM是一類穿梭于核仁、核質和胞質的細胞磷酸化蛋白，參與核糖體的合成、染色體的復制及細胞內信號轉導等，與細胞的生長、增殖密切相關，且與乳腺癌的發生有重要關系[33]。DHX9參與了多個細胞進程,調節細胞不同階段的基因表達,提高DNA復制的保真性和效率,以此維持基因的穩定[34-35]，因此DHX9蛋白功能異?？赡軐е录膊?、腫瘤的發生。乳腺癌1號基因 （breast cancer 1，BRCA1）可抑制乳腺癌的發生，研究發現DHX9可與BRCA1結合，當DHX9過表達時，內源性BRCA1的正常功能被抑制，從而導致乳腺癌的發生[36]，相同的，DHX9也能與乳腺癌缺失基因1（deleted in breast cancer-1，DBC1）相結合，該基因可調節細胞周期，與DHX9結合后，表達降低[37]，促進腫瘤發生。EEF1A與翻譯機制密切相關，且在乳腺癌等多種腫瘤中顯著上調，并促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[38-39]。HSP90參與癌癥信號的傳導，且具有抑制細胞凋亡、調控細胞分裂和促進血管生成等作用，在腫瘤的發生發展中起著重要作用[40]。研究發現，對比健康人群，乳腺癌患者血漿中的HSP-90α高表達[41]。實驗結果顯示，長春新堿處理MCF-7后NPM1，DHX9，EEF1A及HSP90蛋白表達顯著下調，提示長春新堿可能通過調節這幾個蛋白質的表達產生對乳腺癌的抑制生長或促進凋亡作用。

綜上，乳腺癌細胞的代謝方式和途徑存在相互作用和相互聯系，長春新堿可通過影響乳腺癌細胞的生物過程，包括IL-7介導的信號通路、mRNA穩定性、蛋白質-DNA復合體等，也能作用于分子功能如蛋白質泛素化、細胞對淀粉樣蛋白的反應等，且通過對癌癥轉錄失調，細胞周期，抗原處理和遞呈，軍團菌病，泛素介導蛋白水解，剪切體，DNA復制等相關通路的調控影響癌細胞生命活動。故此在治療乳腺癌上應針對疾病病因、機體內環境、代謝方式等，進行多方位、多靶點、多通路干預。采用網絡藥理學方法并結合生物信息學技術，為后續進一步的機制探討奠定了重要的理論基礎，使實驗研究更加具備合理性。