新型靶向αvβ6多肽的設計、 合成與親和力評價

李躍鵬, 王遠強

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院, 重慶 400054)

整合素是細胞黏附分子家族中的重要成員之一, 是一組跨膜糖蛋白受體, 廣泛分布于細胞表面. 整合素的主要功能是介導細胞與細胞、 細胞與細胞外基質之間的相互黏附, 并介導細胞與細胞外基質之間的雙向信號傳導, 對細胞的黏附、 增殖、 轉移、 凋亡起重要的調控作用. 整合素是由α亞基和β亞基通過非共價鍵組成的跨膜異二聚體糖蛋白, 目前已發現18種α亞基和8種β亞基, 可形成24種不同的整合素受體[1]. 其中,αvβ6是唯一由β6亞基參與形成的異源二聚體整合素. 整合素αvβ6在健康的成人上皮中不表達或表達很弱, 但在創傷愈合、 纖維化和炎癥等生理或病理過程中, 甚至在一些惡性腫瘤中, 它的表達水平顯著上調, 該特征使整合素αvβ6在各種疾病診斷與治療中成為一個非常有吸引力的靶點[2-3].

目前文獻報道的靶向αvβ6配體包括小分子配體和多肽類配體, 其中多肽類配體主要包括定向工程化噬菌體展示獲得的多肽R01和S02[4], 基于向日葵胰蛋白酶抑制劑噬菌體展示篩選得到的多肽SFLAP3[5], 源于口蹄疫病毒外殼的多肽A20FMDv2[6], 噬菌體展示文庫篩選得到的多肽DLXXL[7], 以及天然配體Pro-TGF-β1和TGF-β3[8]. 其中[18F]氟苯甲?；鶚擞浀碾腫18F]FBA-A20FMDv2已在人類臨床試驗中用作PET放射性示蹤劑, 用于特發性肺纖維化的診斷和治療評估. 研究表明, 盡管多肽配體沒有直接的抗癌活性, 但可以作為分子成像載體用于癌癥等疾病診斷, 以及通過與藥物或納米粒的偶聯進行整合素靶向腫瘤治療. 靶向整合素放射藥物已是比較成熟的研究方向, 此類藥物結合了兩種關鍵元素: 一種靶向化合物/配體和一種放射性同位素[9]. 靶向放射性藥物可以與腫瘤組織中的特異性靶點結合并聚集, 通過放射性射線產生電離輻射作用, 由于正常組織細胞與腫瘤組織細胞對射線的敏感性不同, 因此可以實現腫瘤的靶向治療或根據放射性射線對腫瘤進行精準診斷. 如177Lu-PSMA-617(Novartis)即將被批準用于前列腺癌的診療[10], 由北京大學王凡課題組研發的中國首個核醫學腫瘤顯像診斷1類新藥99mTc-3PRGD2已完成三期臨床[11]. 因此開發具有靶向αvβ6作用的多肽配體具有重要意義.

針對目前αvβ6結合多肽基本含有RGDLXXL(X為任意氨基酸)核心結構, 且該結構處于專利保護范圍內, 本文擬篩選設計非專利范圍內全新結構的αvβ6結合多肽配體. 先通過分子模擬方法分析αvβ6與多肽配體的結合模式, 再通過計算機輔助藥物設計方法發現一種全新結構的αvβ6多肽配體, 該配體具有良好的結合親和力, 可為后續的靶向αvβ6多肽和多肽-核素復合物研究提供理論與實際研究指導, 是一個具有發展前景的先導化合物.

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

Fmoc-氨基酸(上海麥克林生化科技股份有限公司), 2-氯代三苯甲基氯-樹脂(阿拉丁試劑(上海)有限公司), 二氯甲烷(DCM)、 二甲基甲酰胺(DMF)、 二異丙基乙胺(DIEA)和乙腈等(國藥集團化學試劑有限公司), 人整合素αvβ6蛋白(MedChemExpress LLC)、 鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(Streptavidin-HPR)和3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)顯色液(上海碧云天生物技術有限公司), A20FMDv2(NAVPNLRGDLQVLAQKVART)、 A20FMDv2-Biotin(Biotin-NAVPNLRGDLQVLAQ-KVART)和A20FMDv2-GRD(NAVPNLGRDLQVLAQKVART)(核欣(蘇州)醫藥科技有限公司), 酶聯免疫吸附試劑盒(江蘇酶免實業有限公司).

液相制備色譜儀(LC-20AP型, 日本島津公司); 三重四級桿液-質聯用儀(AGILENT 6470型, 美國安捷倫科技有限公司); 全波長酶標儀(Multiskan SkyHigh型, 美國賽默飛世爾科技公司).

1.2 分子模擬方法

1.2.1 分子對接

采用Sybyl-X 1.3進行分子對接, 靶蛋白αvβ6源自蛋白質結構數據庫(Protein Data Bank, https://www.rcsb.org, ID: 5FFO), 配體來源于文獻、 有機小分子生物活性數據庫(PubChem, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)和藥物化學數據庫(Chembl, https://www.ebi.ac.uk/chembl/)等. 使用Sybyl軟件的Surflex-Dock模塊, 將蛋白晶體結構中天然配體所在位置定義為活性結合口袋. 利用Surflex-Dock GeomX(SFXC)模塊進行高精度分子對接, 分子對接參數: 配體分子初始構像數目為10, 分子片段最大構像數目為20, 分子最大可旋轉鍵數據為100, 其他參數默認. 綜合結合構像和對接打分構建αvβ6-多肽復合物用于分子動力學模擬.

1.2.2 分子動力學模擬和結合自由能計算

本文所有分子動力學模擬均在Linux工作站用Amber 16[12]計算.αvβ6使用FF14SB力場, 多肽配體使用GAFF力場和AM1-BCC電荷, 將多肽-蛋白體系浸沒于0.15 mol/L氯化鈉溶液(TIP3P)的立方體盒子中, 復合物距立方體盒子邊緣為1.00 nm, 體系包含98個Na+, 78個Cl-, 36 206個水分子. 模擬過程如下: 首先進行5步能量優化, 避免可能的分子碰撞; 其次進行兩步加熱, 使體系溫度從0逐漸升溫到303.15 K, 并進行溶液密度調整和體系平衡; 最后在303.15 K下對系統(NPT)進行100 ns的動力學模擬, 時間步長為2 fs, 壓力恒定為1個大氣壓. 結合自由能以及能量分解計算由Amber的MMPBSA.py程序完成[13], 選取最后20 ns進行計算并取其平均結構進行結合模式分析, 分析αvβ6與配體的結合模式. 當結合自由能的值為負值時, 體系是穩定的, 且該值越小配體-受體結合親和力越高.

1.2.3 組合虛擬篩選

本文虛擬篩選由SYBYL-X 1.3完成. 首先以RGDLXXL為基礎, 在5,6號位通過20種天然氨基酸的隨機組合建立一個含400條多肽的多肽文庫, 通過Rosetta軟件[14]對多肽進行批量結構優化構建虛擬肽庫, 根據1.2.1節中定義的活性口袋進行虛擬篩選, 綜合結合構像以及對接打分篩選出最佳結合七肽. 然后將篩選出的七肽作為核心逐步延長多肽鏈, 同理篩選出最佳結合八肽、 九肽和十肽用于進一步研究. 結合模式分析結果表明, 現有多肽配體與αvβ6的結合主要為九肽和十肽核心結構, 因此將篩選出的九肽、 十肽和骨架RGDLXXL進行氨基酸替換, 如亮氨酸可替換為纈氨酸, 二者等電點相近, 分別為5.98和5.96, 側鏈結構相似, 分別為異丙基和異丁基, 二者均為帶疏水性側鏈的脂肪族氨基酸, 氨基酸替換時在改變多肽結構的同時盡量不改變其理化性質. 在保持多肽關鍵結合氨基酸不變的情況下, 進一步構建虛擬肽庫, 通過與上一步相同的虛擬篩選、 精準對接、 分子動力學模擬獲得最佳結合多肽配體, 利用分子動力學模擬和結合自由能能量分解計算驗證結構改造的合理性.

1.3 多肽固相合成方法

用DCM激活樹脂后, 通過DIEA將第一個氨基酸耦聯到樹脂上, 然后用哌啶/DMF保護第一個氨基酸, 通過茚三酮實驗確認氨基酸耦合后用DMF和甲醇洗滌樹脂. 使用預活化的第二個氨基酸、 肽耦合試劑HBTU和DIEA溶液進行耦聯, 確認耦聯后, 重復洗滌, 重復去保護和耦合循環, 直到獲得所需的肽鏈長度. 最后將樹脂結合的多肽轉移到圓底瓶中, 通過n(TFA)∶n(H2O)∶n(EDT)∶n(TIS)=94.5∶2∶2.5∶1的組合溶液同時去除樹脂和保護基團. 再利用制備型高效液相色譜結合梯度洗脫對多肽進行分離純化, 其中乙腈/水為流動相, 檢測波長為214 nm. 最后用液質聯用儀(LC-MS)確認目標產物.

1.4 ELISA法測定結合親和力

人源αvβ6蛋白經包被、 封閉后, 在孔板中加入待測配體溶液. 其中空白組僅加入100 μL TBS緩沖溶液; 空白對照中加入A20FMDv2-Biotin 和TBS緩沖溶液各50 μL; 陽性對照加入A20FMDv2-Biotin 和A20FMDv2(梯度)各50 μL; 陰性對照加入A20FMDv2-Biotin 和A20FMDv2-GRD各50 μL; 實驗組加入A20FMDv2-Biotin 和待測多肽(梯度)各50 μL. 每組設置3個平行試驗. 反應2 h后, Streptavidin-HRP用PBST稀釋100倍, 向各孔加入100 μL, 室溫振搖反應后, 向各孔加入100 μL TMB顯色液, 立即將孔板置于酶標儀中避光孵育, 每5 min讀取一次650 nm波長處的吸光度(A)值, 共讀取1 h(13個檢測點).

2 結果與討論

2.1 αvβ6與現有配體的結合模式

現有αvβ6多肽配體的分子對接與結合自由能計算結果列于表1. 由表1可見, 分子對接打分選取結合構像最佳的對接結果, 所有配體分子與αvβ6的結合自由能為-147.753 4～-92.888 7 kJ/mol. 結合自由能能量分解結果表明,αvβ6與多肽配體形成的基本強相互作用: ArgRGD側鏈通過氫鍵與αv亞基Asp218上的羧基形成氫鍵; 多肽的側鏈殘基與β6亞基種金屬離子依賴的黏附位點中Mg2+形成配位鍵; 配體中-LXXL-部分可以形成兩親性α螺旋, 并且該螺旋結構與β6亞基形成的特異性疏水口袋結合, 該結合模式為后續設計的多肽是否合理建立標準.

表1 現有αvβ6配體分子對接以及結合自由能計算結果

2.2 靶向αvβ6多肽配體的設計

以RGDLXXL為核心初步篩選多肽配體的分子對接以及結合自由能計算結果列于表2. 結合自由能除七肽較低為-26.318 6 kJ/mol外, 其他3條多肽結合自由能均小于-62.802 0 kJ/mol. 虛擬篩選的多肽與αvβ6結合模式如圖1所示. 由圖1可見, 七肽除必要的結合作用外, 還與Tyr178形成鍵長為0.29,0.39 nm的氫鍵, 并與Glu698形成鍵長為0.35 nm的氫鍵; 八肽除必要的結合作用外, 還與Asn693和Ser602分別形成鍵長為0.38,0.31 nm的氫鍵; 九肽除必要的結合作用外, 還與Tyr178,Asp729,Thr696,Asp695分別形成鍵長0.32,0.32,0.40,0.38 nm的氫鍵; 十肽除必要的結合作用外, 還與Tyr178,Ser602,Thr696分別形成鍵長為0.40,0.32,0.39 nm的氫鍵.

圖1 虛擬篩選的多肽與αvβ6結合模式Fig.1 Binding patterns of virtual screening of polypeptides and αvβ6

表2 多肽虛擬篩選、 設計分子對接以及結合自由能計算結果

考慮到現有研究中的配體均基于RGDLXXL配體, 本文對初步篩選出的九肽和十肽的氨基酸殘基進行替換篩選, 探索全新結構的αvβ6多肽配體, 最終得到2條多肽, 分別為RGDVGRVGR和RTDVGRVRGR. 2條多肽配體與αvβ6結合模式如圖2所示. 由圖2可見, 2條多肽與αvβ6的結合模式與現有配體一致: 多肽RTDVGRVGRG除必要的結合作用外, 還與Asp150,Asp148,Ile147,Glu121,Ser656,Glu698分別形成鍵長為0.29,0.34,0.35,0.31,0.32,0.32 nm的氫鍵; 多肽RGDVGRVGR除必要的相互作用外, 還與Tyr178,Asp695,Thr696,Lys119,Ser656,Pro654,Lys645分別形成鍵長為0.38,0.27,0.23,0.33,0.29,0.29,0.28 nm的氫鍵.

圖2 氨基酸替換后多肽結合模式Fig.2 Polypeptide binding pattern after amino acid substitution

2.3 多肽合成結果

本文合成了4條多肽, 分別為P1(GRTDLGTLLFR), P2(GRRTDLATIHG), P3(RTDVGRVRGR), P4(RGDVGRVGR). 其中P2為pro-TGF-β1配體的RGD特征片段[15-17], 在后續研究中作為設計多肽親和力測定的對照, P1為重慶理工大學靶向藥物篩選與活性評價課題組原有肽庫篩選出的配體, P3和P4為本文結構優化后的多肽配體.

根據高效液相色譜(HPLC)結果, P1純度為98.461%, P2純度為95.749%, P3純度為95.135%, P4純度為97.554%. 根據LC-MS結果, P1計算的摩爾質量為1 248.42 g/mol, 測量的摩爾質量為1 249.00 g/mol; P2計算的摩爾質量為1 196.31 g/mol, 測量的摩爾質量為1 196.70 g/mol; P3計算的摩爾質量為1 171.31 g/mol, 測量的摩爾質量為1 171.35 g/mol; P4計算的摩爾質量為971.07 g/mol, 測量的摩爾質量為971.25 g/mol. 可見, 經HPLC以及LC-MS分析, 確定合成的多肽為本文研究的目標產物.

2.4 親和力測定結果

酶聯免疫吸附(ELISA)實驗采用飽和濃度法進行計算[18], 即體系反應達到最大響應值的50%時的濃度為結合親和力濃度. 每個孔位設置3組平行試驗, 測量數據結果顯示標準差不超過平均值的15%. 測試樣品吸光度在進行計算時應減去標準品濃度為0的A平均值, 即只加了TBS緩沖液的孔位吸光度. 采用A20FMDv2作為陽性對照(親和力3 μmol/L), 利用Origin 2016對標準品吸光度及濃度繪制四參數邏輯函數曲線, 計算陽性對照達到最大反應響應值的濃度約為40 μmol/L, 如圖3所示. 利用Biotin標記的A20FMDv2作為檢測目標分子, Streptavidin-HRP可與Biotin-A20FMDv2形成穩定復合物, 當待測多肽與αvβ6結合時溶液中的Biotin-A20FMDv2濃度增加, TMB可與Streptavidin-HRP生成藍色化合物進而檢測溶液吸光度. 根據4條待測多肽的A值以及濃度、 陽性標準品的吸光度, 繪制多肽-蛋白結合率和多肽濃度相關性曲線, 結果如圖4所示. 由圖4和吸光度數據可以計算出P1的親和力為3.35 μmol/L, P3的親和力為10.76 μmol/L.

圖3 陽性對照A20FMDv2的濃度-吸光度曲線Fig.3 Concentration-absorbance curve of positive control A20FMDv2

圖4 待測多肽的濃度-結合率曲線Fig.4 Concentration-binding rate curves of tested polypeptide

2.5 討 論

本文通過分子對接與分子動力學模擬分析αvβ6與配體的結合模式, 虛擬組合篩選獲得符合結合模式的全新結構多肽, 采用固相合成法合成多肽, 通過間接ELISA法測定多肽配體與αvβ6的結合親和力. 實驗結果表明: 多肽配體P3與αvβ6具有良好的結合親和力, 略大于陽性對照A20FMDv2的結合親和力, 基本符合設計預期. 實驗中P2和P4由于親和力較弱, 僅存在陽性結果, 無法計算其親和力值. P1雖然也有較強的αvβ6蛋白結合親和力, 但其結構仍具有RGDLXXL核心, 因此在后續的研究中可作為先導化合物改造其結構. P3和P4雖都為氨基酸替換后篩選出的多肽, 但其結合親和力差距較大. 綜合分子對接和結合自由能相關計算結果, 推測P4活性較差的原因是其-VGRVGR-部分的空間位阻較小, 而αv與β6亞基形成的結合空腔較大, 二者結合時存在一定的結合不穩定性. 結構生物學研究表明,αvβ6不僅能識別RGD序列, 還能識別-LXXL-基序, 該基序折疊成兩親性α-螺旋, 結合至β6亞基殘基組成的疏水口袋中[15-17]. 研究中篩選出全新結構多肽含有的-VXXV-序列也可以形成兩親性α-螺旋, 該螺旋可與β6亞基形成更多氫鍵相互作用, RTD序列也可以與αvβ6形成穩定的氫鍵, 表明了本文采用氨基酸替換方法的合理性. 可見, 計算機輔助藥物設計方法可有效提高藥物開發的成功率、 降低研發成本并縮短研發周期, 是創新藥物研發的重要方法.

文獻研究表明, 整合素αvβ6的表達在許多腫瘤中顯著上調, 包括口腔鱗癌、 乳腺癌、 胃癌、 胰腺癌、 結直腸癌、 肺癌等[18-20]. 整合素αvβ6的表達與許多癌種患者的生存率降低相關, 例如結直腸癌、 乳腺癌、 胰腺導管腺癌、 非小細胞肺癌和宮頸鱗狀細胞癌等[21-25], 并且可以通過纖維連接蛋白和膠原中的RGD序列參與腫瘤細胞與胞外基質的相互作用, 該整合素的過度表達與上皮細胞向間充質樣細胞轉化有關, 可促進腫瘤細胞的侵襲和遷移, 通常在腫瘤侵襲病灶的前沿部分中整合素的表達水平較高. 目前, 靶向整合素成像已成為整合素研究熱點之一, 包括正電子發射斷層掃描和單光子發射計算機斷層掃描, 整合素顯像劑可用于對患者分層進行靶向治療、 評估治療反應, 并監測腫瘤生長[26-30]. 由于大部分基礎生物學仍未完全了解, 因此αvβ6為靶標的治療腫瘤藥物也尚未開發, 但其仍有作為診斷靶點的潛力.

綜上所述, 本文采用計算機輔助藥物設計的方法設計了一條基于RTDVXXV全新結構的αvβ6多肽配體, 研究結果表明, 該配體具有良好的結合親和力, 配體分子可作為靶向αvβ6多肽或肽類結合物開發的候選分子, 為未來αvβ6結合配體的開發提供結構基礎.