外泌體調控胚胎發育的研究進展

盧永昌,甘建宇,黃思秀,洪林君

(華南農業大學 動物科學學院,國家生豬種業工程技術研究中心,廣東 廣州 510642)

胚胎的正常生長發育需要與母體之間建立正確的信息交流,胚胎在子宮中所處的微環境直接影響到胚胎的生長發育。外泌體作為胚胎生長發育的重要調控因子之一,其中所含物質的變化有可能會導致胚胎生長發育受阻甚至死胎[1]。近年來,外泌體在調節胚胎微環境影響胚胎生長發育的機制正受到越來越多的關注。但研究主要聚焦于外泌體中的一些蛋白質、RNA或其他因子的含量變化,對于外泌體在胚胎發育過程的具體影響作用機制的研究尚沒有特別深入,因此深入分析外泌體所含物質對胚胎發育的調控作用能夠有效提高胚胎成活率,有力推動家畜的遺傳選育。本文對外泌體與胚胎發育間的聯系做一綜述,以期對外泌體對胚胎發育的影響機制提供參考。

1 外泌體概述

外泌體(Exosome)是內源性脂質納米粒(LNP)與細胞內的多囊小體融合后,通過細胞間的囊泡轉運機制主動分泌到細胞外液中的一種細胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)[2],直徑約為30～100 nm[3]。Salamonsen等[4]在2013年首先報道了人子宮內膜上皮細胞系ECC1可以產生EVs,并證實了子宮腔液中存在外泌體。研究發現,外泌體對人[5]、大鼠[6]、牛[1]、羊[7]和豬[8]等多種哺乳動物的妊娠過程和胚胎發育過程發揮著重要作用,并具有免疫調節、調控細胞分裂、分化、抗氧化等多方面的功能。對母胚交流、胚胎發育有影響作用的外泌體主要來源于胎盤[9]、子宮內膜[4]和胚胎[10],且不同器官產生的外泌體有著不同的功能,其引起介導作用的程度也均不相同[11-16]。胚胎產生的外泌體能夠在母體的子宮內膜中被發現,而胚胎同樣可以吸收子宮內膜中產生的外泌體,從而對自身的發育起到影響作用[10]。這意味著外泌體的相互傳遞是母體與胚胎之間的一種交流形式[17],也反映了不同來源的外泌體具有相互影響的作用。

2 外泌體對胚胎發育的影響

胚胎以外泌體為媒介與母體子宮內膜“溝通”。存在于外泌體內的RNA(如microRNA (miRNA)、mRNA、長非編碼RNA (lncRNA)、環狀RNA (circRNA)等[11])一般被統稱為外泌體穿梭RNA (esRNA)。esRNA在與靶細胞膜轉運結合過程中傳遞到靶細胞基質中,并通過多個機制影響著細胞的生命活動[19]。外泌體中的部分內容物在促進胚胎附植、調控基因表達、影響組織器官形成等方面發揮著重要作用。

2.1 胚胎發育過程

輸卵管中精子與卵子通過受精作用融合發育成為受精卵。受精卵在透明帶中不斷卵裂,在經歷多次有絲分裂過程后進入桑葚胚期。受輸卵管生理環境影響,桑葚胚之前較容易出現發育阻滯和胚胎衰老現象[20],因此早期胚胎發育主要受輸卵管環境調控[21]。隨著胚胎的不斷發育,在受精后6 d左右(如,豬需要5～6 d,牛7～8 d,羊6～7 d)[22],胚胎細胞開始分化進入囊胚期,此時囊胚游離于子宮腔液中,并處于自由狀態。囊胚從透明帶(ZP)的孵化是胚胎發育過程中的一個關鍵過程,以豬為例,這個過程大約在第8天時結束。這一階段由于早期精卵細胞較弱,受精卵的活力低,因此容易死亡并被母體吸收。囊胚向子宮移動一段時間后,最終附植在子宮內血管稠密的地方。附植的部位以及附植的方式在各種動物中存在較大差異。豬的胚胎通常附植于子宮角子宮系膜的對側,由于大量滋養層細胞與子宮內膜靠接、粘連逐漸形成彌散型上皮絨毛膜胎盤,微絨毛在子宮內膜的陷窩中與母體子宮上皮交錯伸入即完成胚胎的附植。這個時期的胚胎將面臨發育過程中的首個死亡高風險時期[23]。這一時期的宮內環境是胚胎死亡的關鍵因素,大多數有染色體疾病的胚胎在此階段死亡。據報道,豬在附植期間胚胎死亡率可以達到30%～40%[24]。存活的胚胎繼續發育形成器官,此階段母畜會分泌大量有利于胚胎器官形成的蛋白質[25],此時胚胎開始形成競爭關系,競爭力弱的胚胎因死亡而被淘汰,因而此階段也成為了胚胎第二個死亡高風險時期。在妊娠的中后期,胚胎還會經歷發育過程中的第三個死亡高風險時期,由于胚胎快速發育,子宮內營養物質分布不均,導致一些胚胎死亡[25]。

2.2 外泌體miRNA對胚胎發育的影響

胚胎外泌體RNA中最豐富的是miRNA。miRNA約由22個核苷酸組成,在細胞間物質運輸過程中發揮信號轉導和功能基因表達調控作用[26-28]。外泌體miRNA主要通過調控靶基因表達來增加胚胎粘附能力,促進胚胎附植的作用。如Vilella等[5]通過微陣列分析顯示母體來源的外泌體miRNA可能起到附植前胚胎的轉錄修飾作用,其中在附植窗口期的子宮內膜上皮表達水平上調最顯著的是由腺上皮主動產生的miR-30d,其通過外泌體分泌到子宮內膜腔內并被胚胎內化并上調Itgb3、Itga7和Cdh5等粘附分子的表達來增加胚胎粘附。Gurung等[29]發現,與子宮內膜上皮細胞分泌的其他成分相比較,外泌體對早期胚胎的發育和附植過程有更為顯著的作用,尤其是外泌體中的miRNA能有效提升細胞黏附等相關基因的表達,從而讓子宮與胚胎的黏附更加穩固,使胚胎附植率顯著增加。外泌體中的miRNA不僅能夠通過外泌體運輸至胚胎中發揮作用[30],也能作為預測胚胎質量和判斷胚胎生長發育的指標[31]。Hu等[32]發現,在豬中不同大小的卵泡所產生的外泌體中的miRNA的表達也存在差異,并確定了豬卵母細胞的成熟十分重要的miRNA:miR-125b、let-7d-5p、miR-200b、miR-26a和miR-92a。因此,這些外泌體miRNAs可作為分子生物標志物來選擇高質量的卵母細胞,同時也可猜測這些外泌體miRNAs有可能與胚胎的高質量發育有一定的關系。此外少量miRNA與組織器官的形成和發育有關。Bidarimath等[30]收集并鑒定豬子宮內膜、絨毛膜、尿囊膜、滋養外胚層和主動脈壁細胞釋放的外泌體,發現外泌體中的miRNA與血管形成有關。據此推測,外泌體miRNA能通過調控基因表達影響卵泡發育、胚胎黏附能力和組織器官形成,進而影響胚胎發育。與胚胎發育相關的外泌體miRNA見表1。

表1 與胚胎發育相關的外泌體miRNA

2.3 外泌體lncRNA對胚胎發育的影響

lncRNA是生物體中重要的生物活性物,由200多個核苷酸組成,不具有或只具有有限的蛋白質編碼能力[38]。早期對lncRNA的研究主要集中在胚胎發育過程中的基因印記和劑量補償效應方面[39-40]。研究表明,lncRNA還參與了許多其他的生理過程,例如細胞分裂、細胞分化和先天免疫反應的調節[41-42],由此猜測外泌體中的lncRNA在胚胎發育過程中對細胞分裂和分化也有一定的影響。近年來,研究發現有大量的lncRNAs在胎盤組織和外周組織存在差異表達。Wang等[43]和Kelemen等[44]也發現,一些外泌體中富含特定的lncRNA,同時也存在其他很少見的lncRNA,這證明lncRNAs也可以選擇性地分泌到外泌體中。這些lncRNAs可以多維調節胎盤滋養細胞的生理功能和參與血管生成的調控,從而影響胚胎的發育情況[45]。也有報道稱,外泌體衍生的lncRNA可調節細胞凋亡、增殖、遷移并誘導血管生成[46-47]。Gong等[48]發現間充質干細胞能通過分泌外泌體運輸lncRNA H19,從而分別下調和上調胎盤組織中的miRNA let-7b和轉錄因子FOXO1的表達,使細胞的侵襲和遷移增多,同時也抑制滋養細胞凋亡。因此,子宮腔液外泌體中的lncRNAs是否能正常表達對胚胎發育以及滋養層細胞的功能具有重要的影響。

2.4 外泌體蛋白對胚胎發育的影響

外泌體中的蛋白質通?？煞譃榘麅鹊鞍缀湍さ鞍?。外泌體中的不同蛋白質執行不同的功能[49-50]。已經證實,在胚胎附植期間,外泌體蛋白在母體和胚胎之間的信息傳遞中起作用[51]。外泌體蛋白中沒有內質網、高爾基體、核相關蛋白[52],主要蛋白為CD81、CD63、CD9、溶酶體相關膜蛋白1(LAMOP1)、凋亡轉移基因-2-相互作用蛋白X(Alix)和腫瘤易感基因101蛋白 (TSG101)[53-56]。外泌體中主要蛋白及功能見表2。

表2 外泌體中主要蛋白及其功能[57]

研究發現,在泛素化修飾過程中,轉運必需核內體復合體 (Endosomal complex requned for transport,ESCRT) 通過介導并調節Fas配體進入外泌體,這一過程對于保持外泌體蛋白水平和功能具有重要意義[58]。由于ESCRT機制在外泌體產生過程中的作用以及在外泌體中存在的一些ESCRT的亞單位,人們才能通過操縱ESCRT來調節外泌體的形成。同時外泌體中的蛋白質與外泌體的形成和功能密切相關。例如,小的GTP結合蛋白家族 (Rab27a,Rab11b,ARF6) 參與外泌體的形成和釋放[59]。外泌體的蛋白不僅與外泌體自身有關,還與胚胎發育過程中胚胎的孵化和附植有密切關系。Gurung等[29]在外泌體蛋白質組學研究中確定了外泌體中蛋白酶的存在,包括水解酶(酯水解酶(Ester hydrolase)、二甲氨基水解酶1(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1)、酯酶D(Esterase D)、博萊霉素水解酶(Bleomycin hydrolase)外切核苷三磷酸二磷酸水解酶2(Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2))和金屬蛋白酶(ADAM金屬肽酶含血小板反應蛋白1型15(ADAM-TS15)),這些蛋白酶都可以促進透明帶裂解和提高胚胎孵化,同時通過分析特異性差異蛋白譜還表明,外泌體具有與細胞遷移、粘附和ECM相關的獨特因子。此外,外泌體還可以在免疫系統的調節中發揮重要作用[60]。據此推理,外泌體中絕大多數蛋白都是直接以信號分子的形式轉運到靶細胞中,從而調控胚胎的發育過程。綜合上述分析表明,外泌體所含的蛋白種類對母胚交流與胚胎發育具有深遠的影響,而通過蛋白質組學分析其表達的差異及具體調控機制具有重要意義。

3 小結與展望

綜上所述,外泌體中一些RNA、蛋白質及信號分子主要通過調節基因表達、胚胎-母體通訊、細胞周期、細胞分化、先天免疫反應和胚胎附植等方式來發揮對胚胎發育的調控作用,但其調控機制目前尚未有系統的解析。因此,可在胚胎發育時期進一步分析外泌體內容物的功能,并通過有效的分析技術獲得表達譜,尤其是存在差異表達的內容物,這對研究外泌體對胚胎的調控作用機制,尤其是在胚胎死亡高峰時期的調控機制具有重要研究意義。通過不斷發現外泌體對胚胎發育的作用機制,進一步提高妊娠繁殖效率、促進遺傳育種學科發展,從而更好地為畜牧行業服務。