組織工程皮膚血管化策略及研究進展

劉劍 汪振星 孫家明

【提要】 組織工程皮膚作為皮膚缺損治療的替代解決方案，其核心思想是利用支架、種子細胞或者生物活性分子來促進皮膚的修復重建。在過去幾十年里，該領域發展迅速，各種改善皮膚再生的策略層出不窮。然而，盡管有諸多組織工程皮膚產品已經被商業化生產并應用于臨床，但仍存在諸多問題需要進一步研究解決。其中，組織工程皮膚的血管化是關鍵挑戰之一。目前，已有大量基礎研究致力于解決組織工程皮膚的血管化難題，可以分為兩大類，即基于各種生長因子、種子細胞或活性納米顆粒的促血管生成策略，以及基于組織工程皮膚支架的體內、外預血管化策略。本文將從上述兩個方面分別概述其促進組織工程皮膚血管化的優缺點，并介紹最新進展。

因創傷、體表腫瘤切除、慢性創面等原因造成的皮膚缺損是臨床常見問題。在我國，每年因不同原因造成的皮膚缺損患者高達數千萬[1]。目前，臨床上針對皮膚缺損的治療主要為皮膚移植，包括自體皮膚移植、同種異體皮膚移植、異種皮膚移植三大類，以自體皮膚移植最為常見。然而，上述治療方法雖然能夠有效解決皮膚缺損的問題，但是也有諸多缺點，如造成供區損傷、供區皮膚來源不足、移植物免疫排斥等[2-3]。近年來，隨著組織工程和再生醫學領域的發展，使得皮膚缺損的替代治療成為可能。

組織工程皮膚是指通過組織工程技術，利用細胞或細胞外基質構建的，具有一定生理功能的人工皮膚，可用于修復創面和重建皮膚功能[4]。目前，已有多種人工皮膚產品制備成功，并投入臨床使用。包括表皮替代物、真皮替代物、復合皮膚替代物三大類。代表性產品有Integra、Dermagraft、Apligraf、安體膚等[5]。然而，上述產品對于皮膚缺損的治療，大部分只具備覆蓋創面和促進創面愈合的作用，并不能完整實現皮膚的結構和功能的重建。完整的皮膚結構由表皮層、真皮層和皮下組織三層構成，具有保護、感覺、分泌、代謝等重要作用[6]。其中，表皮層主要由角質形成細胞組成，內部沒有血管網絡結構，主要依靠真皮層中的血管提供營養支持。真皮層主要由成纖維細胞組成，其合成的細胞外基質能夠有效維持皮膚的機械強度和彈性。此外，該層還包含大量的血管網絡結構和皮膚附屬器，能夠有效發揮營養物質運輸和廢物排泄的作用。皮下組織主要是血管化的脂肪組織，對于保持體溫和脂肪儲存具有重要作用。因此，理想的組織工程皮膚除了能夠恢復皮膚的屏障功能外，還應該重建正常皮膚所包含的內部血管結構和附屬器（毛發、汗腺、皮脂腺等），以更大程度實現皮膚的功能重建。其中，血管化難題是制約組織工程皮膚發展的關鍵問題之一。

目前，由于組織工程皮膚內部不具有血管結構，早期營養供應主要依賴創面底部營養滲透作用，因此對于移植皮膚厚度要求較高（一般不超過1.0 mm）[7]。此外，盡管患者自身的血管能夠長入組織工程皮膚內部，但是該過程速度較慢（約5 μm/h）[8-9]，無法滿足大部分細胞的早期營養供應。因此，對于較大、較深范圍的皮膚缺損，則應用受限。為了解決上述問題，促進組織工程皮膚早期血管化的策略已被廣泛研究?？偟膩碚f，這些策略可以分為兩大類，即血管生成和預血管化[10]。其中，血管生成包括在支架植入后刺激支架內血管形成的所有策略，如基于添加各種生長因子和/或接種不同細胞成分從而促進的血管形成。預血管化是指在將組織工程皮膚應用于創面修復之前，即將支架提前血管化的技術[11]。該技術的主要優點在于能夠將血管化的組織工程皮膚早期快速整合至受體的血管網絡中，可有效避免營養供應不足或不均的現象發生。本文將從以上兩個方面分別闡述組織工程皮膚的血管化策略，并介紹最新研究進展。

1 血管生成策略

1.1 基于生長因子的血管生成策略

生長因子是一類通過與特異的、高親和的細胞膜受體結合，調節細胞生長與其他細胞功能等多效應的多肽類物質。生長因子在創面愈合的各階段均發揮著重要作用，如血管內皮細胞因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板源性生長因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）、堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉化生長因子（Transforming growth factor，TGF）、血管生成素等多種生長因子[12-15]。雖然這些生長因子能夠有效促進血管生成，但在生理條件下濃度均較低，無法滿足良好血管化的需求，即無法避免組織缺氧和細胞壞死[16]。因此，通過在組織工程皮膚中直接補充各種生長因子以促進血管形成是一種最直接的辦法。其中，VEGF 自從于1989 年由Leung 等[17-19]首次分離、純化以來，即在組織工程領域尤其在促進創面愈合方面成為研究最為廣泛的生長因子。然而，各種生長因子在體內降解周期較短，無法保持長期穩定存在，因此將其直接應用于體內的促血管生成效應并不確切，而且當使用劑量過大時甚至還可能造成其他不良后果，如腫瘤形成[20-21]。

為了使生長因子能夠在組織工程皮膚中持續、穩定地發揮作用，大量針對藥物釋放系統的研究逐漸成為重點探索方向。常見的藥物釋放系統包括水凝膠、聚合物微納米結構和智能響應系統等。Hosseikhani 等[22]發現，將bFGF 包裹至可注射水凝膠中，可有效延長bFGF 的作用周期，并促進小鼠皮膚血管化。Jiang 等[23]利用聚己內酯（PCL）納米纖維和裝載VEGF 的明膠顆粒作為藥物釋放系統，該體系在2.5 d 內，可快速釋放50%的VEGF；在后續的7.5 d 里，可持續釋放負載總量80%的VEGF，并最終達到促進血管新生、成熟的效果。此外，基于靜電紡絲技術制備的核殼結構、“三明治”結構、層層堆疊結構也是常用的藥物釋放體系[24-25]。以核殼結構為例，外部的殼層結構可充當物理屏障，以減緩核層結構中生長因子的釋放，而且還可通過調節內外層次的組成成分和結構特點，來控制生長因子的釋放速率[26]。Tabata等[27-28]比較了不同組成成分核殼納米纖維釋放bFGF 的情況，兩種核殼納米纖維的外層均基于聚乙二醇（PEG）構成，內層則分別由殼聚糖水凝膠和聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）構成，結果表明前者生長因子釋放較緩慢，而后者速率較快，說明通過核殼結構能夠有效控制生長因子的釋放。上述水凝膠、納米纖維或者其他聚合物微納米結構釋放生長因子的方式，通常依賴于負載材料的降解，這些體系的構建方式不僅簡單，而且一般能夠取得較好的控釋效果。此外，一些載藥體系能夠根據局部微環境的變化或外部刺激來控制藥物的釋放，這些藥物釋放系統被認為是“智能響應系統”。根據所響應刺激的不同，可分為：①溫度響應型[29]；②pH 響應型[29]；③光響應型[30]；④超聲響應型[31]；⑤機械壓力響應型[32]；⑥離子響應型[33]；⑦酶響應型等[34]。為了促進新生血管化，Lee 等[32]率先開發了一種機械刺激響應型釋放系統，其制備的海藻酸鹽水凝膠，可在機械刺激下穩定釋放VEGF-A。體內實驗結果表明，受到機械刺激的糖尿病小鼠新生血管數量明顯增加。Moncion 等[35]制備了超聲刺激響應型的纖維蛋白支架，可在超聲刺激下按需釋放bFGF，可達到促進新生血管化的效果。

1.2 基于細胞的血管生成策略

除了直接應用生長因子之外，通過將細胞接種至組織工程皮膚上，也是促進新生血管形成的重要方法。比較常用的細胞包括多種干細胞、內皮細胞、成纖維細胞等。

干細胞在新生血管形成過程中發揮著重要作用，除了可以通過分泌多種生長因子（包括VEGF-A、FGF、TGF-β 等）來誘導血管內皮細胞的遷移和增殖之外，還可以自身分化為血管內皮細胞直接參與新生血管的形成[36]。根據其來源的不 同，如 內 皮 祖 細 胞（Endothelial progenitor cell，EPC）、骨髓間充質干細胞（Bone marrow-derived stem cell，BMSC）、脂肪間充質干細胞（Adiposederived stem cell，ADSC）、胚胎干細胞（Embryonic stem cell，PSC）、 誘 導 多 能 干 細 胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）等，均在組織工程皮膚中有所應用。EPC 因同時具備內皮細胞和祖細胞的特征，在促進組織工程皮膚血管化方面應用廣泛[37]。Zhang 等[38]將EPC 接種于商品化的Integra基質上，2 周后觀察發現，與未接種細胞的支架相比，皮膚血管化程度顯著增加。Wang 等[39]研究了聚己內酯-膠原生物活性支架在接種骨髓來源的EPC 之后，能夠通過激活HIF-α、SDF-1α 通路來促進新生血管的形成，并改善傷口的愈合。

除EPC 之外，BMSC、ADSC 也被廣泛用于促血管化相關研究。Chen 等[40]將BMSC 誘導分化后，通過分析其內皮特異性標志物的表達和功能，證實了BMSC 具有較好的促新生血管化作用。Lin等[41]進一步證明了將BMSC 接種至合成支架上能夠有效誘導新生血管化，促進皮瓣的再生。雖然BMSC 可有效促進組織血管化，但是獲取骨髓的方式為侵入性操作，使其在臨床使用上受限。相較于BMSC，ADSC 的獲取更為方便，對于供體的損傷也較輕，而且獲得的干細胞數量是骨髓來源方式的500 倍[42]。Eke 等[43]將ADSC 整合至明膠/透明質酸水凝膠中，體內試驗結果表明，與無細胞水凝膠相比，含有ADSC 的水凝膠誘導形成的新生血管數量增加了3 倍，證實了ADSC 促血管生成效應。Hu 等[44-45]直接將ADSC 接種至全層異體皮膚上用于小鼠慢性創面的修復，結果表明接種ADSC 的實驗組能夠顯著提高移植物存活率并促進血管化。

iPSC 在促進組織工程皮膚血管化方面也具有巨大的潛力。Lin 等[46]通過誘導iPSC 衍生的間充質干細胞，獲得了具有血管生長潛能的表皮樣細胞系，為構建良好血管化的組織工程皮膚提供了新的選擇。Tan 等[47]將iPSC 衍生的血管內皮細胞接種至聚己內酯-明膠納米纖維支架上，體外結果表明，負載有iPSC 衍生的血管內皮細胞的支架在培養7 d 后，促血管生成生長因子相關基因表達上調。植入大鼠皮下后，多普勒灌注監測顯示，經由接種細胞的支架處理后的大鼠血液灌注明顯增高。免疫組化檢測結果也表明接種細胞組的毛細血管密度明顯升高。然而，iPSC 的使用受到諸多安全問題的限制，如腫瘤形成相關風險。因此，在廣泛臨床應用之前，該方法尚需進一步深入研究[48]。

除了干細胞之外，一些體細胞也具有促進血管化的潛力，其中最常使用的便是血管內皮細胞。血管內皮細胞是構成血管的基本組分之一，目前使用細胞來促進血管化的策略中，大部分都直接或間接地使用了血管內皮細胞。Abaci 等[49]通過將人來源的血管內皮細胞混合至膠原中培養，顯著增加了組織工程皮膚的血管化程度，有效避免中心區域組織的壞死，并促進了毛發的再生。成纖維細胞作為參與傷口愈合的主要細胞，也具有輔助新生血管形成的作用。其分泌的纖維蛋白和細胞外基質分子能夠促進其他細胞在三維支架內部的黏附和增殖，對于血管內皮細胞的存活及其組成新生血管具有極其重要的作用[50]。

1.3 基于活性納米顆粒的血管生成策略

除了上述兩類比較常見的血管生成策略之外，一些基于活性納米顆粒的血管生成策略也被陸續研究。這些活性納米顆?？梢酝ㄟ^誘導活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的生成，或者通過負載一些活性分子，如質粒DNA、MicroRNA、GF等，來達到促進新生血管形成的效果[51-52]。

一些金屬或者非金屬的納米顆粒已經陸續被證明可通過誘導ROS 的生成來達到促進血管生成的效果。ROS，是生物有氧代謝過程中的一種副產物，包括氧離子、過氧化物和含氧自由基等，因其存在未配對的自由電子，而具有很強的化學反應活性。在高濃度水平下，具有很強的細胞毒性，可引起氧化應激反應、內皮細胞功能障礙和慢性炎癥等[51]。然而，在低濃度水平下，卻能刺激細胞的增殖、遷移和分化，甚至還可以通過p38MAPK/Akt、HIF-1α 信號通路來調節血管生成相關基因的表達及生長因子的分泌[53]。其中，關于氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）/還原氧化石墨烯（Reduced graphene oxide，rGO）[54]、氧化鋅（ZnO）/過氧化鋅（ZnO2）[55]、碳納米管（Carbon nanotubes，CNT）[56]等納米材料的研究尤為廣泛。Mukherjee 等[54]證明了GO 和rGO 在濃度低于50 ng/mL 時具有促血管生成效應；體外遷移試驗證明，相較于VEGF（40 ng/mL），GO 和rGO 在促進血管內皮細胞遷移方面具有更好的效果。但在高濃度GO/rGO 水平下，則會抑制新血管的形成，甚至破壞原有的血管結構。這可能與過高濃度ROS 造成的氧化應激反應有關。Li 等[57]證實，混合有低濃度GO 的膠原蛋白支架能夠促進創面的愈合，并提高新生血管化程度。ZnO/ZnO2在促進創面愈合上也具有良好作用。Augustine 等[58-59]利用聚己內酯納米纖維負載低濃度的ZnO，用于豚鼠全層皮膚缺損修復的研究。結果表明，質量分數為1%的ZnO 支架能夠促進大量血管生成，全層皮膚缺損創面可于5 d 內完全修復。需要指出的是，利用上述納米顆粒來促進血管生成的效應是濃度依賴性的。因此，嚴格控制誘導ROS 生成的納米顆粒濃度非常關鍵，否則可能會造成不利后果。

除了上述通過誘導ROS 的生成來促進新生血管形成的納米顆粒之外，還有一些納米顆?？赏ㄟ^直接負載活性分子的途徑來達到促進新生血管化的效果。Devalliere 等[60]利用PLGA 納米顆粒來負載microRNA-132 活性分子，并將其進一步轉染人靜脈內皮細胞（Human umbilical vein endothelial cell，hUVEC），在體外試驗中達到了促進hUVEC 遷移、增殖的效果，且體內試驗發現微血管化程度提高近2 倍，證明該納米顆粒負載的microRNA-132 活性分子能夠抑制p120RasGAP的表達，進而激活Ras 系統，從而促進新生血管形成[61]。Dong 等[62]將可編碼VEGF 的mRNA 負載到可電離脂質納米顆粒中，該脂質納米顆粒通過表達VEGF 蛋白達到顯著提高新生血管化的效果。He 等[52]則將編碼VEGF 的質粒DNA 負載到PLGA/聚乙醇胺納米顆粒上，并取得同樣的效果。此外，Lai 等[63]的研究證明，明膠納米顆粒負載PDGF 活性分子，在體外試驗中可促進hUVEC 的生長，并形成管腔樣結構；將其應用于糖尿病大鼠創面修復，可促進創面的愈合。

2 預血管化策略

上述各種血管生成策略從不同角度提出了促進組織工程皮膚血管化的新方法，但均受限于新生血管較慢的生長速度。因此，對于大尺寸的皮膚缺損修復，使用含有預先建立有血管網絡的組織工程皮膚支架或許更有優勢，此即為預血管化策略。該策略是指在將生物支架植入受體之前，即在內部制備好微血管網絡[11]。根據構建方式的不同，可分為體外預血管化和體內預血管化兩類。

2.1 體外預血管化構建策略

體外預血管化的構建依然離不開細胞這一重要原料，但是與前文提到的血管生成策略不同的是，負載細胞的支架在移植至受體之前即在體外形成了成熟的毛細血管或血管樣結構[64]。因此，當將血管化的支架移植至創面時，能夠快速與受體自身血管網進行整合，從而達到早期提供營養支持的目的。Abaci 等[65]通過3D 打印技術，首先在組織工程皮膚支架內部構建出管腔樣結構，然后將iPSC 來源的內皮細胞接種至管腔結構中，從而達到在體外構建預血管化組織工程皮膚支架的目的。當將該支架用于小鼠全層皮膚缺損修復時，相較于未預血管化的支架，前者血流灌注明顯，新生皮膚結構更加成熟、完整。Hanjaya-Putra 等[66]將內皮集落形成細胞及多種生長因子包被至透明質酸水凝膠支架中，體外培養第2 天即可見成管、出芽等行為的發生，而在第3 天即可見成熟的血管網絡。當將這些預血管化的支架植入小鼠皮下時，可見宿主血管網長入支架內部，并與預先建立的血管網絡迅速形成吻合，從而達到為組織細胞早期提供營養支持的目的。Kong 等[67]將iPSC來源的內皮細胞與人冠狀動脈平滑肌細胞在多孔聚氨酯支架中共培養，發現支架內部形成毛細血管，并在體外可存活3 d。當將其植入宿主體內時，這些預先形成的血管網絡同樣可與宿主毛細血管形成吻合。

2.2 體內預血管化構建策略

體內預血管化策略是指利用機體本身作為生物反應器，在植入體內的支架中形成新的血管[68]。最簡單的方法即將支架植入表淺且血管豐富的組織中，如皮下袋、肌袋。在一定時間內，機體的血管就可隨機長入支架中，即完成了支架的預血管化操作。Laschke 等[68]將PLGA 支架植入小鼠皮下，20 d 后將帶血管的支架進一步轉移至背側皮膚內，并評估血液灌注及細胞存活情況。結果表明，血管化的PLGA 支架的血液灌注量比未血管化的支架高近20 倍。動靜脈環技術也是一種重要的體內預血管化方法[69]。人為構建的動靜脈環既可直接提供主要的血液灌注和營養支持，有可以誘導周邊小血管的形成。該方式在大體積的組織器官（如乳腺）的修復重建中具有非常廣闊的應用前景，但在皮膚缺損修復重建中應用較少。

雖然預血管化策略在構建血管化組織工程皮膚上有其獨特的優勢，但在實際應用中依然面臨諸多挑戰。很多支架材料在內部結構設計上沒有模擬細胞外基質的特性，孔隙度較小，宿主血管無法長入支架內部。其結果是，在支架內部雖然可見成熟血管的形成，但是無法實現灌注功能。一般認為，支架孔隙率大于70%時，才有較好的促血管生成效果。Choi 等[70]的研究表明，當支架孔徑>200 μm 時，有利于形成低密度但是管徑較大的血管網絡；當支架孔徑<200 μm 時，則易形成高密度但是管徑較小的血管網絡。利用動靜脈環技術構建預血管化支架的方式在操作上比較復雜，對機體損傷較大，在臨床實際應用中并不常見。目前，關于利用預血管化的方式構建組織工程皮膚的研究報道較少，尚需更多臨床前和臨床試驗評估其臨床應用潛力。

3 總結與展望

目前，關于促進組織工程皮膚血管化的研究層出不窮，而且均不同程度達到了促進新生血管化的要求。然而，每種方法的使用均有其局限性。隨著對血管形成機制的不斷了解和深入，將血管生成策略與預血管化策略進行結合，并設計出模擬天然組織生長環境的支架結構，有望更好地促進組織工程皮膚血管化形成，并投入臨床使用。