益生菌在慢性創面愈合中的研究進展

林崴儀 戈成旺 唐梟偉 蔡薇 宋輝 李磊 沈干

【提要】 慢性創面發病率高，創面愈合困難，通常需要綜合治療?，F有的研究發現，應用部分益生菌及其代謝產物可以抗感染、促進創面細胞增殖、調控炎癥，從而促進慢性創面的愈合，證明了益生菌應用于慢性創面愈合擁有巨大潛力。本文主要就目前益生菌在促進慢性創面愈合中的使用方法，及其與各種組織細胞的相互作用進行綜述，以期為慢性創面的綜合治療提供一個新的方向。

慢性創面又稱慢性潰瘍或慢性難愈合創面，國際上尚無統一定義。國際傷口協會將慢性創面定義為：無法通過正確有序而及時的修復過程達到解剖和功能完全修復的創面，或在沒有建立持續性的解剖及功能條件下進行修復的創面，常因為壓力、缺血、糖尿病、感染等原因難以愈合[1]。臨床上多指由各種原因引起的接受1 個月及以上正規治療不愈合或無愈合傾向者，通?？蓪⒙詣撁娌∫蚍譃殪o脈性潰瘍、動脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、壓力性潰瘍、創傷性潰瘍[2]。慢性創面病因復雜，愈合難度大，通常需要綜合性治療，但效果仍然不理想。如糖尿病足，高達28% 的患者需下肢截肢，接受截肢患者若無預防意識，其中的50%～80% 患者在第二年可再次出現潰瘍[3-5]。

大量研究表明，在各種疾病中，腸道及皮膚益生菌微生物群發生了變化，提示益生菌及其代謝產物對人類健康促進及某些疾病變化有著積極作用[6]。益生菌具有調節免疫、減輕炎癥、抑制感染等功效，應用部分益生菌可以促進慢性創面愈合，但是目前的研究有限，作用機制不明確，仍需進一步深入研究。本文就目前益生菌在促進慢性創面愈合中的使用方法，及其與各種組織細胞的相互作用進行綜述，以期為慢性創面的綜合治療提供一個新的方向。

1 促進慢性創面愈合的益生菌使用方法

1.1 口服益生菌

早期研究發現，腸道疾病及某些代謝性疾病引起腸道內菌群失調，而補充足量特定的益生菌對于某些疾病有著顯著的治療作用，因腸道微生物群調節宿主生理穩態介質，包括免疫系統、腸道屏障功能和疾病易感性途徑[7]。燒傷導致腸道內微生物菌群失調，產丁酸鹽菌屬及乳酸菌豐度明顯下降，而機會致病菌豐度明顯上升[8]。將益生菌作為膳食補劑可促進慢性創面的愈合，臨床上通常應用于燒傷創面的治療中?？诜嫔{節腸道屏障功能，增強免疫，減輕炎癥，降低感染率，緩解膿毒血癥，有助于創面愈合和縮短康復時間[9-10]。在一項口服益生菌促進小鼠皮膚創面愈合的實驗中發現，口服益生菌可減少巨噬細胞和肥大細胞浸潤，減輕炎癥反應，并加速局部血管生成，促進創面上皮化[11]。

對于口服益生菌促進創面愈合的機制，有研究認為可能是通過腸道-皮膚軸實現的。腸道微生物失調可以引起皮膚病變，這可能是由于腸道微生物失調引起全身免疫發生變化，調節全身炎癥反應，最終影響到皮膚免疫。例如，口服發酵乳桿菌可增強T 淋巴細胞增殖能力，加強巨噬細胞吞噬作用，刺激髓系樹突狀細胞成熟的能力等，從而提高全身免疫[12]。腸道菌群失調與某些皮膚炎性病變，如銀屑病、特應性皮炎等，有著密不可分的聯系[13]，炎癥性腸病表現出的皮膚病變也佐證了腸道菌群可以影響皮膚這一點[14]。有研究進一步提出，腸道益生菌的皮膚效應是通過腸道-腦-皮膚軸得以實現的，即口服益生菌促進了腦內某種神經活性物質的分泌，并最終反饋到皮膚組織。例如，口服羅伊氏乳桿菌后，通過激活迷走神經通路上調了催產素的表達，激活宿主CD4+Foxp3+CD25+免疫T 調節細胞，使得小鼠背部創面愈合時間僅為對照組的一半[15]。

1.2 局部應用益生菌及其代謝產物

口服益生菌雖對慢性創面恢復具有一定療效，但慢性創面的治療仍然以局部護理為主。有研究嘗試將益生菌及益生菌產物局部應用于創面，發現對慢性創面的愈合具有促進效果，但相關的臨床研究尚處于初始階段。

在早期的一項臨床試驗中，Peral 等[16]將植物乳桿菌用于感染性Ⅱ度、Ⅲ度燒傷創面，與傳統的殺菌劑、磺胺嘧啶銀比較，其在抑制細菌載量、提供肉芽組織創面床方面有著更加優秀的效果。近期，一項小型的糖尿病足潰瘍臨床實驗中，將植物乳桿菌局部給藥作為手術清創的輔助手段，益生菌表現出顯著的抗感染能力，可促進纖維增加、血管生成，并促進巨噬細胞從促炎型M1（CD68）到抗炎型M2（CD163）表型極化，加強了中性粒細胞的吞噬作用，從而加速創面愈合[17]。在另一項下肢靜脈潰瘍的臨床研究中，植物乳桿菌通過抑制中性粒細胞產生的炎癥因子白細胞介素8（IL-8），改善局部炎癥，促進靜脈潰瘍愈合[18]。一項治療口腔復發性阿弗他潰瘍的臨床研究發現，將含植物乳桿菌的蘆薈發酵凝膠涂抹于患者潰瘍部位，可以加速潰瘍的愈合；同時，使用DNA 提取及高通量測序發現，含植物乳桿菌的蘆薈發酵凝膠可以使口腔微生物更快恢復多樣化[19]。

開菲爾顆粒是一種多種益生菌混合而成的益生菌復合物，通常由乳桿菌、乳鏈球菌、醋酸菌、酵母菌等微生物組成，局部應用可加速大鼠燒傷創面血管、膠原的生成，加速創面整體收縮[20]。唾液鏈球菌K12 局部應用于小鼠的由放射引起的口腔黏膜潰瘍創面，可促進潰瘍愈合，基底層上皮細胞密度及黏膜厚度增加，促使上皮細胞增殖，抑制細胞凋亡[21]。將干酪乳桿菌上清液局部應用于銅綠假單胞菌定植的大鼠Ⅱ度燒傷創面中，顯著抑制了銅綠假單胞菌感染，效果甚至強于應用亞胺培南的陽性對照組[22]，同時增加了表皮和真皮的最大厚度[23]。在燒傷動物模型局部應用益生菌，不僅可以抑制感染，同時還可以減輕感染后的瘢痕形成。在兔的感染性燒傷模型中，植物乳桿菌不僅減輕了銅綠假單胞菌感染的嚴重程度，縮短了感染持續時間，同時在創面愈合后的瘢痕組織中，益生菌治療顯著減少了感染傷口中Ⅰ型膠原纖維及總膠原蛋白的積累，與未感染傷口顯示出幾乎同樣的效果[24]。

上述研究結果表明，局部應用益生菌及其產物，對慢性創面的愈合具有極大的臨床治療潛力。

1.3 局部應用基因工程菌

除了口服益生菌補劑和局部應用益生菌發酵上清液或滅活菌株，另一種治療策略是利用基因工程技術，將編碼某種促進愈合的基因轉入到益生菌中，形成基因工程菌。將基因工程活菌應用于傷口治療，因活性益生菌活躍的新陳代謝，可持續表達某些有益物質，可以更加有效地抑制病原菌的黏附、增殖，促進慢性創面的愈合。將含有編碼趨化因子CXCL12 基因的羅伊氏乳桿菌應用于小鼠創面治療，持續產生的乳酸降低了局部pH 值，抑制了肽酶CD26，提高了CXCL12 生物活性；另外，基因工程菌產生的CXCL12 通過上調巨噬細胞TGF-β 的表達，促進真皮細胞增殖，有效促進傷口閉合[25]。另一項研究顯示，同樣編碼CXCL12 基因的基因工程菌在豬的創面上也呈現出類似效果[26]?；蚬こ叹衅洫氂械膬瀯?，克服了單獨使用益生菌產物藥效不能持久、需要多次給藥的缺點，證明了基因工程菌應用于慢性創面治療的可行性。

2 益生菌抑制病原菌感染

創面不愈合的原因錯綜復雜，病原菌感染在其中具有重要的作用。大多數定植在慢性創面的病原菌屬于21 個科，葡萄球菌科及假單胞菌科是慢性創面中最常見的菌屬[27-28]。慢性創面上的病原菌可分泌多種毒力因子及蛋白酶，從而抑制傷口愈合[29]，同時還可形成生物膜，阻止抗生素殺滅細菌[30]。

2.1 益生菌直接抑制病原菌活力與毒力

多項研究表明，益生菌對于慢性創面常見致病菌存在顯著抑制作用。益生菌能產生過氧化氫、有機酸、抗菌肽、細菌素等物質抑制病原菌。干酪乳桿菌分泌乳酸、醋酸、丁二酸、檸檬酸等有機酸抑制銅綠假單胞菌的黏附過程[23]。發酵乳桿菌產生的細菌素和胞外多糖同樣抑制了銅綠假單胞菌的增殖及其生物膜的形成[31]。一種酵母提取液可以顯著抑制多種金黃色葡萄球菌α-溶血素和腸毒素A 基因的表達以及生物膜的形成[32]。部分益生菌對真菌具有顯著的抗菌作用，如嗜熱鏈球菌對白假絲念珠菌具有顯著抗菌活性[33]，鼠李糖乳桿菌顯著抑制熱帶念珠菌、克魯氏假絲酵母菌和近平假絲酵母菌等非白念珠菌[34]。

2.2 益生菌抑制群體感應

益生菌抗菌的另一種機制可能給是對于群體感應（Quorum-sensing，QS）產生抑制作用。隨著細菌種群數量不斷增長，細菌會產生一種自體誘導物的信號分子，當達到一定閾值時，會開啟細胞密度依賴的特定基因表達，這種通信系統則為群體感應。群體感應廣泛參與細菌生物膜的形成及毒力因子的產生[35]。一種由水產飼料分離出來的短乳桿菌通過下調銅綠假單胞菌LasA 和LasB 基因，調節了群體感應系統，抑制了生物膜及綠膿素的形成[36]。乳桿菌產生的另一類二酮基哌嗪類化合物，抑制了?；呓z氨酸內脂類分子（AHLs），從而可抑制銅綠假單胞菌毒力[37]。

3 益生菌促進慢性創面組織細胞生長

創面愈合的增殖期以大量細胞生長及細胞外基質堆積為顯著特點。在細胞方面，成纖維細胞、角質形成細胞、內皮細胞在慢性創面組織增殖期中起到了關鍵的作用。細胞外基質主要包括蛋白多糖、透明質酸、膠原和彈力蛋白，在肉芽組織的形成中發揮重要作用。在此期間，多種細胞因子、生長因子、趨化因子廣泛參與其中[38]。益生菌不僅可以保護創面細胞免受病原菌的毒害，還可以直接促進成纖維細胞、角質形成細胞、內皮細胞的增殖和遷移，抑制細胞外基質的降解，減輕局部炎癥反應，促進慢性創面組織生長，加速創面愈合。

3.1 益生菌與成纖維細胞

益生菌通過促進成纖維細胞增殖、遷移，加強膠原分泌，從而縮小創面，加速創面愈合。開菲爾顆粒與成纖維細胞共培養后，MTT 增殖實驗及細胞劃痕實驗證明，開菲爾顆粒促進成纖維細胞增殖和遷移，且呈劑量依賴性增加。在大鼠燒傷創面中，開菲爾顆粒增加堿性成纖維生長因子（bFGF）、降低炎癥因子白細胞介素-1（IL-1）表達，促進燒傷創面中的膠原形成，加速愈合[20]。在另一項實驗中，從乳桿菌分離出來的胞外多糖與成纖維細胞體外共培養，能促進成纖維細胞的增殖與遷移，同時抑制彈性蛋白酶、膠原酶和基質金屬蛋白酶活性，抑制細胞外基質降解[39]。羅伊氏乳桿菌上清液通過抑制炎癥，促進牙齦成纖維細胞生長，其分泌的前列腺素E2（PGF-E2），可能在炎癥消退中發揮重要作用[40]。

3.2 益生菌與角質形成細胞

益生菌還可以通過促進角質形成細胞增殖，來加速慢性創面的上皮化，提供上皮屏障保護。多項對角質形成細胞的體外實驗證明了其優秀的保護作用。長雙歧桿菌、植物乳桿菌、路氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等，能有效促進人原代表皮角質形成細胞的增殖遷移，增強了緊密連接，降低細胞通透性，從而抵抗病原菌的入侵[41]。長雙歧桿菌通過調節Toll 樣受體-2（TLR-2）加強緊密連接[41]，鼠李糖乳桿菌上調了趨化因子CXCL2 及其受體CXCR2 在內的多個基因的表達，對角質形成細胞的生長遷移至關重要[42]。植物乳桿菌和唾液乳桿菌還參與角質形成細胞的特定蛋白組學的調節，其中涉及白細胞介素型增強因子結合因子2 和ATP 依賴的RNA 解旋酶等調節蛋白，和細胞因子、核因子-κB、Hedgehog、RUNX 信號失調，這些蛋白質和途徑與創面愈合和抗炎密切關聯[43]。但不是所有乳桿菌對角質形成細胞都表現為有益作用，如發酵乳桿菌對角質形成細胞的增殖可產生抑制作用[41]。

3.3 益生菌與血管內皮細胞

創面的愈合與內皮細胞的血管生成行為關系密切，多項研究表明，益生菌分泌的后生元在大鼠創面模型中可促進血管內皮細胞的生長。如熱滅活乳桿菌制劑[18]、羅伊氏乳桿菌、發酵乳桿菌和納豆枯草芽孢桿菌[44]用于大鼠創面模型，可使局部血管生成增加。益生菌促進創面血管內皮生長的機制尚未完全闡明，其中的分子機制可能是促進了低氧誘導因子2α（HIF-2α）的表達，有研究表明鼠李糖乳桿菌在小鼠體內實驗中誘導了HIF-2α 的表達上調[45]，這是一種在創面修復中具有招募各種祖細胞、干細胞作用的重要調節因子，參與血管網的形成，加速創面愈合。

4 益生菌調節免疫

4.1 益生菌與巨噬細胞

巨噬細胞表型的變化與慢性創面愈合的過程緊密相關，M1 型巨噬細胞表現為促炎性，產生多種促炎因子，加強炎癥，細胞外基質降解，促進病原菌的吞噬；M2 型巨噬細胞表現為抗炎性，抑制炎癥因子的產生，促進血管生成，分泌多種生長因子，抑制細胞外基質的降解，加速創面的愈合[46]。在慢性創面中，如糖尿病慢性潰瘍，巨噬細胞表型失衡抑制了創面的正常愈合，在糖尿病患者及動物模型中促炎性M1 型巨噬細胞占主導地位，表現為持續的炎癥狀態并延遲傷口愈合[47]。而益生菌具備調節巨噬細胞表型變化的能力，在糖尿病足創面愈合研究中，植物乳桿菌作為手術清創的輔助手段，在治療第7 天、14 天、21 天創面取材，免疫組化結果顯示促炎性M1 巨噬細胞（CD68+）明顯減少，抗炎性M2 巨噬細胞（CD163+）表達高于對照組[17]。植物乳桿菌的胞外囊泡與人單核細胞THP1 細胞共培養后，CD209、C 型凝集素結構域家族5 成員A（CLEC5A）、CD200 R、鞘氨醇激酶1（SPHK1）、A 類清道夫受體1（SRA1)、IL-1 受體和CD163 偏向性高表達，這些細胞表面標志和細胞因子與M2 巨噬細胞相關，促進人單核細胞THP1 細胞向抗炎性M2 巨噬細胞表型分化。即使是在干擾素-γ 和脂多糖誘導的促炎條件下，植物乳桿菌胞外囊泡依然抑制了M1 巨噬細胞的誘導作用，減輕M1 巨噬細胞的炎癥影響[48]。然而，益生菌對巨噬細胞的極化作用似乎表現出菌株特異性。目前的研究顯示，糞腸球菌、德式乳桿菌、嗜熱鏈球菌等誘導巨噬細胞向M1 型極化，而植物乳桿菌、長雙歧桿菌、短乳桿菌、枯草芽孢桿菌等促使M2 型極化，降低炎癥反應，促進愈合[49]。

4.2 益生菌與中性粒細胞

益生菌還可以調節中性粒細胞活性，增加其吞噬作用，促進對病原菌的吞噬。植物乳桿菌上清液與糖尿病患者中性粒細胞共培養，可增強糖尿病患者中性粒細胞對金黃色葡萄球菌的吞噬作用，甚至與健康人群相當[17]。中性粒細胞分泌的炎癥介質白細胞介素-8（IL-8），對中性粒細胞具有極強的趨化作用。將植物乳桿菌應用于糖尿病患者小腿潰瘍治療中，通過提高IL-8 水平，可促使中性粒細胞從外周血創面聚集來抑制病原菌的定植[18]。

5 總結與展望

慢性創面的遷延不愈是患者及社會沉重的負擔，隨著細菌耐藥性的不斷上升，慢性基礎疾病引起的局部炎癥反應加重，創面愈合越發困難。慢性創面的綜合治療是當今的研究熱點，各種抗菌藥物、生物支架層出不窮，益生菌治療提供了一個全新的方向，有望進一步推動慢性創面的綜合治療。但目前的研究多數僅停留在益生菌的抗菌作用及對慢性創面愈合的促進作用，其具體機制的研究尚淺；另外，對于益生菌的給藥方式、給藥劑量、藥物劑型、給藥時間等還缺乏統一的認知，目前還無法形成規范化、系統化治療。但已有的體內、外研究已經表明了慢性創面的益生菌療法擁有極為廣闊的應用前景，有望成為促進慢性創面愈合的有效手段。