皮膚衰老相關的生物標志物及其作用機制的研究進展

王玨 王佳琦 陳珩 邱馨毅 郭曉晴 周栩

【提要】 皮膚老化是人體衰老的直接表現，是遺傳和環境因素共同作用的結果，表現為皮膚結構、功能和外觀的累積性變化，如皺紋增多、松弛、彈性減退、毛細血管擴張、皮膚色素異常等，延緩皮膚老化對維護人們的心理健康和皮膚的正常生理功能具有重要意義。皮膚老化是一個高度復雜且尚未完全明了的過程，目前還無法根據單一的生物標志物明確檢測和評估衰老。本文對衰老相關的生物標志物及其作用機制進行了詳細闡述。

皮膚是人體最大的器官，占體質量的10%～15%，是人體與外部環境之間的首要防御屏障，具有重要的功能，包括保護、體溫調節、感知、分泌、排泄和免疫等[1-2]。皮膚老化可分為內在老化（自然老化）和外在老化（主要指光老化）。自然老化指的是因年齡增長而產生的變化，不僅發生于皮膚，也發生在所有組織上；而作為人體最外層的器官，皮膚遭受著環境因素的損害，由此產生的皮膚老化被稱為外在老化，例如空氣污染、吸煙，以及被稱為光老化原因的紫外線照射等[3]。無論是內因還是外因產生的老化，都會導致皮膚結構完整性的下降和生理功能的喪失，造成皮膚干燥、功能失調、皮膚病發生率增加[4]。

皮膚衰老相關生物標志物的研究，有助于更深入地理解皮膚老化的分子機制，有助于皮膚老化的早期診斷，并為皮膚年輕化提供潛在的新治療靶點。本文對皮膚老化的相關原因以及生物標志物及其作用機制進行了詳細的闡述。

1 內在老化

皮膚的內在老化是一個漸變的生理過程，內在老化最明顯的組織學變化表現在基底細胞層，隨著年齡增加，基底細胞層的細胞增殖減少，真皮成纖維細胞的數量減少，細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）中膠原蛋白和彈性蛋白的合成能力下降，特別是Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，導致真皮變薄，皺紋增加和彈性減弱。其明顯特征是皮膚變薄、干燥、細小皺紋、出汗不足，以及對溫度的敏感性增加；皮脂的分泌隨著年齡的增長而減少[5]。此外，慢性瘙癢在衰老的皮膚中極為常見，表明與年齡有關的麥克爾細胞的損失導致觸覺轉為瘙癢[6]?；|金屬蛋白酶（MMPs）在衰老的成纖維細胞中表達增加，而金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）表達減少，是另一個與皮膚老化有關的因素。然而，由于暴露于外界，皮膚往往同時經歷著內在老化和外在老化，以面部、頸部、前臂和小腿皮膚為著[7]。

2 外在老化

早在1969 年，有研究提出，除了內在因素，陽光照射也會導致皮膚老化[8]。暴露在紫外線下導致的光老化約占面部老化的80%以上[9]。陽光中的紫外線根據其波長主要包括三種類型，長波紫外線（UVA，320～400 nm）、中波紫外線（UVB，280～320 nm）和短波紫外線（UVC，200～280 nm）[10]。UVC 具有極強的致突變性，但受阻于臭氧層而無法到達地表；UVA 有很強的穿透能力，可以影響真皮甚至皮下組織區域，但誘變性較弱；UVB 誘變性強，可直接與DNA 發生作用，產生胸腺嘧啶二聚體光產物，導致DNA 損傷[11]。

紫外線導致的光老化會使皮膚變得粗糙、失去彈性、產生皺紋；此外，還會導致皮膚下毛細血管擴張，引起表皮增厚，與內在老化造成的表皮變薄形成鮮明對比[12]。光老化引發了角質細胞活性下降，皮膚更新速度減緩，導致表皮層的屏障功能減弱，臨床表現為皮膚干燥和脫皮。與內在老化相比，光老化真皮層的成纖維細胞數量減少更為嚴重，膠原蛋白和彈性蛋白的合成速率降低，同時分解加速[13]。由于膠原蛋白降解的增加，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白減少，導致真皮變??；角質細胞中Ⅶ型膠原蛋白的表達減少。Ⅶ膠型原蛋白是真皮-表皮交界處的錨定纖維，由于真皮和表皮之間的連接減弱，導致了皺紋的產生[14]。同時，朗格漢斯細胞減少，導致免疫力下降；無定形彈性纖維積累，膠原蛋白破壞和紊亂，導致皮膚彈性降低[15]。此外，紫外線照射會刺激黑色素細胞，促進黑色素的生成和遷移，從而形成老年斑。紫外線輻射還會導致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產生，引發有害的氧化應激反應，激活花生四烯酸途徑，并介導炎癥反應[16]。急性紫外線照射還可能引發曬傷、異常色素沉積，而長期暴露則可能導致惡性腫瘤[17]。

3 皮膚老化的生物標志物

盡管受到不同的刺激誘導，皮膚中的老化細胞有一些共同特征，使其在體外和體內都能被識別。皮膚老化相關的生物標志物，可以評估皮膚老化的程度，以及老化相關疾病導致的變化，并有效識別干預措施的效果對。皮膚衰老相關生物標志物及其作用機制的了解，有助于進一步了解皮膚衰老的現象和機制。

3.1 衰老相關β-半乳糖苷酶（Senescence associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal）

Dimiri 等[18]發現，正常狀態下溶酶體β-半乳糖苷酶在pH 為4 時可以檢測到，而衰老細胞在pH 為6 時亦可檢測到β-半乳糖苷酶，被稱為衰老相關的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal），成為識別體外和體內衰老細胞最廣泛使用的生物標志物。Lee 等[19]發現，SA-β-gal 活性的增加來源于編碼溶酶體β-半乳糖苷酶的基因GLB1。隨著年齡增長，有絲分裂后細胞中溶酶體內的脂褐素積累，溶酶體的數量和大小隨之增加[20]。體外和體內衰老細胞（低溫保存組織）中脂褐素和SA-β-gal 的共定位被證實，表明脂聯素也可作為細胞衰老的生物標志物[21]。SA-β-galactivity 與衰老細胞高度相關，但并不是所有的衰老細胞都表達SA-β-Gal，其在老化的成纖維細胞和角質細胞中表達，但在靜止狀態的成纖維細胞和終末分化的角質細胞中則不表達[18]。

3.2 細胞周期調節器

衰老細胞不可或缺的標志是其穩定的細胞周期停滯：衰老細胞停滯在細胞周期的G1/S 期，失去有絲分裂的能力，但仍保持代謝活性。與靜止期不同，衰老細胞的生長停滯是永久性的，不能被任何生理性刺激激活，即使在有利的生長條件下，也喪失了重新進入細胞周期的能力。同時，衰老細胞也不同于終末分化細胞，后者盡管也不可逆地退出了細胞周期，但其是一個明確的發育程序的結果，而細胞衰老是基于細胞的應激反應形成的[22]。衰老細胞退出細胞周期是由p53/p21 CIP1 和p16 INK4a/Rb 腫瘤抑制通路的激活所控制的[23]。p21 是p53 最經典的靶基因。在衰老期，被激活的p21 特異性地與G1 期的細胞周期蛋白/循環蛋白激酶復合物結合，抑制周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-dependent kinase 2，CDK2） 的 活 性，導致視網膜母細胞瘤蛋白（Retinoblastoma protein，Rb）磷酸化減少和細胞周期退出[24]。細胞受到暫時的應激時，p53 誘導細胞進入靜止狀態并激活DNA 修復過程，應激消除后，細胞恢復周期。持續應激可激活p16INK4a（CDK4 和CDK6 的抑制劑），導致細胞周期長期停滯[25]。紫外線照射后的人類皮膚成纖維細胞（hDFs）顯示p53、p21 和p16 的上調[26]。此外，小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）和人類黑色素瘤細胞也顯示了同樣的結果[27]。

3.3 衰老相關異染色質灶（Senescence-associated heterochromatin foci，SAHF）

Narita 等[28]發現，衰老細胞的DNA 包含點狀異染色質域，極易與非衰老細胞的染色質區分開來。衰老的啟動引發了不同異染色質結構的產生和積累，這些結構被稱為衰老相關異染色質灶，異染色質區域常常發生組蛋白H3 上第9 位賴氨酸Lys9 的甲基化（K9M-H3），其為異染色質蛋白HP-1（Heterochromatin protein 1，異 染 色 質 整合時必需的銜接分子家族）提供了結合位點，由于衰老細胞中HP-1、K9M-H3 與SAHF 定位的一致性，兩者成為標示SAHF 的標志蛋白，可通過DNA 染料DAPI 檢測[29]。p16 的過量表達可以通過激活Rb 促進SAHF 的形成，表明p16/Rb 途徑在SAHF 的形成中起著重要作用。在用Ras 誘導衰老并抑制p16 或Rb 的細胞中，盡管細胞仍然進入衰老狀態，但SAHF 的形成明顯減弱[30]。高遷移率蛋白A（High-mobility group A，HMGA）是一種富集在染色質中的非組蛋白，當HMGA 的表達量增加時，SA-β-Gal 的活性增加，SAHF 的形成增強，細胞的生長明顯受到抑制。當HMGA 在衰老細胞中被抑制時，SAHF 的形成會減弱，其他衰老跡象也會減少，這表明HMGA 蛋白對SAHF 的形成至關重要[30]。p16 和HMGA 可以以協同的方式共同促進SAHF 的形成。但SAHF 不能在所有物種的衰老細胞中檢測到，因此作為一個衰老的生物標志物有其局限性。

3.4 核纖層蛋白B1（Lamin B1）

細胞核通常由核孔復合體、核基質和核纖層組成。核纖層位于內核膜的核基質表面，是一種由核纖層蛋白（Lamin）構成的網狀結構。Lamin屬于中間纖維蛋白家族，為核膜提供支撐和維持結構穩定性。在動物細胞中，存在A、B 兩種Lamin 類型，B 型Lamin 由LMNB1 和LMNB2 編碼[31]。近年來，有研究表明，在復制性衰老和致癌基因誘導的衰老中，Lamin B1 的表達降低，通過依賴于p53 和Rb 的信號通路延緩了細胞增殖并促進了細胞衰老[32-33]。此外，Lamin B1 與自噬過程也存在密切關聯。在細胞衰老時，核自噬被異常激活，從而導致Lamin B1 的表達下降[32]。Lamin B1 與自噬相關蛋白LC3 結合后，通過囊泡從細胞核運輸到細胞質，然后由溶酶體降解。研究發現，通過阻斷肽（Lamin B1 類似物）抑制LC3 和Lamin B1之間的相互作用可以延緩細胞衰老[34]。

另外，Lamin B 受體（LBR）和核纖層蛋白相 關 多 肽（Lamina-associated poly-peptide 2α，LAP2α）也顯示下調[35]。然而，LBR 在不同表皮層中的表達存在差異，這可能限制了其作為皮膚老化的適當生物標志物的使用。研究發現，Lamin B1 的表達在靜止細胞中保持穩定，而LAP2α 的丟失不僅發生在衰老細胞中，也發生在靜止細胞中。因此，共同檢測Lamin B1 和LAP2α 可以更好地區分衰老細胞和靜止細胞[35]。

3.5 端粒

端粒是真核細胞線性染色體末端的DNA-蛋白質復合體，由富含G 的核酸重復序列和蛋白質組成，被認為是細胞衰老的生物標志之一[36]。人類端粒主要由5’-(TTAGGG)n-3’重復DNA 序列構成，總長度2～15 kb。在DNA 半保留復制過程中，由于DNA 聚合酶無法進行3’→5’合成，導致子鏈末端無法進行擴展。隨著細胞分裂次數的增加，端粒逐漸縮短。端粒的關鍵作用是維持染色體的結構穩定，以阻止染色體融合、降解或不穩定結構形成，端?？s短使端粒失去保護染色體的能力，縮短至極限時，正常的端粒結構無法維持，細胞就會出現不可逆的生長停滯，從而導致細胞發生衰老和死亡。雖然DNA 損傷不是衰老的生物標志物，但由此產生的端粒功能障礙誘發的病灶（Telomere dysfunction-induced foci，TIF）經常被用來檢測和量化衰老細胞[37]。

在靈長類皮膚成纖維細胞中，隨著年齡增長，觀察到TIF 逐漸增多，端粒酶被激活。端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白復合體，由端粒酶逆轉錄酶（hTERT）、端粒酶RNA 模板（hRNA）和相關蛋白組成[36]，具備自主合成端粒DNA 序列的能力，并將其附加到端粒末端，從而有助于維持端粒的長度，修復斷裂的染色體末端，減輕細胞分裂過程中的端粒損傷，減緩細胞的老化過程，進而起到維護遺傳穩定性的作用。然而，在人體內，端粒酶的表達水平除了在造血干細胞、生殖細胞和胚胎細胞中較高外，幾乎無法在正常細胞中檢測到。因此，將端粒酶檢測應用于衰老判斷時，主要適用于生殖細胞、干細胞和多數癌細胞的研究，而不適用于正常細胞。

3.6 衰老相關分泌表型（Senescence -associated secretory phenotype，SASP）

SASP 是指衰老細胞分泌多種細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白酶和脂質的現象，通過自分泌和旁分泌途徑可能引發機體內的炎癥反應，并向周圍細胞傳遞衰老信號[38]。分泌物的組成因衰老觸發因素而異，包括促炎因子（IL-1、IL-6 和IL-8 等）、趨化因子（CXCL-1、CXCL-3、CXCL-10）、生長因子（HGF、GM-CSF 和TGF-β 等）、胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBPs）和金屬蛋白酶（MMPs），以及金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）等[39]。SASP 有助于加強衰老細胞的細胞周期停滯，刺激免疫系統清除潛在的致癌細胞，限制纖維化，促進傷口愈合和組織再生；另外，SASP 還可能介導了慢性炎癥，加速機體老化，刺激腫瘤細胞的生長。隨著年齡的增長，機體的免疫功能下降、自噬失調和端?？s短等變化導致衰老細胞的積累增多，從而引發了炎癥因子水平的上升，這可能進一步促使疾病發生。因此，SASP 可被視為細胞老化的一個重要特征[40]。

研究指出，IL-6 與由DNA 損傷引起的角質細胞、黑素細胞和成纖維細胞的老化過程相關聯[41]。在老化的成纖維細胞、上皮細胞以及由化療誘導的老化腫瘤細胞中，IL-1 的表達增加，能夠與IL-1 受體或Toll 樣受體結合，進而激活NFκB，促進SASP 的表達[42]。Quan 等[43]在年齡老化和光老化的皮膚中觀察到MMPs 的高水平表達，以及膠原蛋白基質的快速降解。

研究衰老對細胞或組織微環境的影響時，SASP同樣具有重要的生物學意義；然而，SASP 作為皮膚老化的生物標志物有一定的局限性，比如IL-6和IL-8 也參與炎癥反應等其他生理過程，因此需結合其他生物標志物來共同判斷衰老的發生[44]。

3.7 皮膚老化的其他生物標志物

皮膚老化過程中膠原蛋白持續減少，而皮膚膠原蛋白中以羥脯氨酸的含量最高，因此羥脯氨酸可以作為評價皮膚老化的一個指標[45]。透明質酸是一種酸性黏多糖，由皮膚中的纖維母細胞分泌，具有重要的保水作用，其含量隨著年齡的增加而逐漸減少[46]。Ishitsuka 等[47]發現，鹵化酪氨酸在光暴露和光保護的皮膚中隨年齡增長而增加，表明其可能是一個有用的皮膚老化生物標志物。在衰老的細胞中，高遷移率族蛋白B1（High mobility group box 1，HMGB1）從細胞核轉移到細胞質和細胞外空間，促進SASP 的釋放，如IL-1β、IL-6 和MMP-3[48]。

綜上所述，皮膚老化是人體衰老的直接表現，是遺傳和環境因素共同作用的結果，延緩皮膚老化對維護人們的心理健康和皮膚的正常生理功能具有重要意義。檢測衰老生物標志物可以對體外或體內的衰老細胞進行定性或定量分析，并有助于對衰老組織和機體中細胞衰老的功能進行研究。但是，目前的生物標志物存在很多局限性，尚無一種生物標志物能夠準確、穩定地檢測出衰老細胞。因此，我們需要在不同情況下選擇合適的生物標志物，并且繼續不斷發現、改進新的生物標志物和檢測皮膚老化的方法，以更進一步理解皮膚衰老的生理、生化機制。