數據挖掘聯合網絡藥理學探討苦木抗腫瘤活性研究及驗證

劉亞群，張振霞，黃瓊露，楊培奎，陳良輝，王俊利，鄭玉忠，?

（1.韓山師范學院 生命科學與食品工程學院，廣東 潮州 521041; 2.右江民族醫學院 臨床醫學院，廣西 百色 533000）

癌癥已經成為嚴重威脅全球健康的主要公共衛生問題之一，其發病率和死亡率呈逐年持續上升趨勢，防控形勢嚴峻.目前，化療是臨床治療腫瘤的常見并有效的方法，已有大量抗腫瘤化療藥物被批準上市，然而化療藥物伴隨著毒副作用、靶標選擇性差和腫瘤多藥耐藥性等問題［1］.眾所周知，中藥因具有整體觀念、藥物毒副作用較小等優勢，未來在抗腫瘤制劑的發展前景非常廣闊［2］.但是中藥抗腫瘤已呈現出扎堆開發態勢，規范性和可操作性問題已凸顯，同時中藥成分雜靶點多，傳統逐一靶點驗證研究方式過于繁瑣，無法全面性地探索藥物機制［3］.網絡藥理學以其多成分-多靶點-多通路的新理念，為中藥抗腫瘤系統研究提供了新思路，為臨床治療及新藥開發提供了參考［4］.

苦木（Picrasma quassioides）是苦木科（Simaroubaceae）苦木屬（Picrasma）植物，產于我國黃河流域以南各地.其以干燥枝和葉入藥，性寒，味苦，小毒.具有清熱，祛濕，消炎等功效，臨床上主治感冒、上呼吸道感染、急性扁桃體炎、腸炎、細菌性痢疾等炎癥疾?。?］.苦木的現代藥理研究多聚焦于抗菌抗炎［6-7］，本研究利用數據挖掘和網絡藥理學技術對苦木進行了成分檢索、靶點預測、通路和疾病聚焦，推測苦木可能參與子宮癌、肺癌和食道癌的靶點或信號通路，并利用人宮頸癌細胞株C33A、人食道癌細胞株ECA-109和人非小細胞肺癌A549進行體外實驗驗證，以期為苦木抑制腫瘤細胞增殖作用機制研究及新藥研發提供理論依據與科學思路.

1 材料

1.1 藥物與試劑

材料：苦木片購置于（四川平原）永康中藥批發養生堂，經清洗晾干后粉碎備用.人宮頸癌細胞株C33A 購自上海鈺博生物科技有限公司，人食道癌細胞株ECA-109 購自宏偉藥業公司，人非小細胞肺癌A549 購自明舟生物科技有限公司.試劑：噻唑藍（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide）購自北京索萊寶科技有限公司，二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），無水乙醇，磷酸二氫鉀，氯化鈉和氯化鉀購自西隴化工股份有限公司，胎牛血清FBS 和PRMI1640 培養基購自上海素爾生物科技有限公司，胰蛋白酶購自上海藍科技發展有限公司，青霉素和鏈霉素購自山東魯抗醫藥股份有限公司，十二水合磷酸氫二鈉購自LifeScience Products&Services，碳酸氫鈉購自上海虹光化工廠.

1.2 儀器

真空凍干機（FDU-2110，EYELA），熒光顯微鏡（IX2-ILL30，Olympus），酶聯免疫檢測儀（CMax Plus，Molecular），恒溫培養箱（Heraeus 311，廣東丹利科技有限公司），超聲提取器（AS 系列，天津奧特塞斯儀器有限公司），旋轉蒸發儀（N-1100，Tokyo Rikakikai Co.Ltd）.

2 方法

2.1 苦木化學成分庫建立及活性成分篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），中藥整合藥理學研究平臺（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP，http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html）以及大量文獻檢索建立苦木化學成分庫.進一步以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和藥物相似性（Drug likeness，DL）≥0.18 為標準來進行活性成分的篩選.同時在Swiss ADME 數據庫（http：//www.swissadme.ch/）中以胃腸道吸收Giabsorption 為High，并符合類藥性評估規則的六個指標五倍率法則Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge和生物利用度預測值Bioavailability Score≥0.55為指標進一步進行活性成分在線代謝預測.

2.2 苦木活性成分潛在作用靶點預測

在PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載苦木活性成分所對應的SMILE（Simplified Molecular Input Line Entryspecification）格式化學式，將相應化學式導入Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）平臺，設置屬性為“Homo Sapiens”，進行活性成分的潛在作用靶點預測.

2.3 苦木活性成分潛在作用靶點PPI網絡圖構建

將苦木潛在作用靶點導入STRING 數據庫（https：//cn.string-db.org/），選擇最低互作閾值Minimum required interaction score 為Highest confidence 0.900，去除游離節點，其余設置均為默認，得到蛋白互作PPI （protein-protein interaction） 網絡圖.將蛋白互作網絡導入Cytoscape 3.8.0 軟件（https：//cytoscape.org/）進行拓撲分析，利用Cytohubba 插件中的Degree 算法篩選出得分前15 的蛋白作為中心Hub蛋白.

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

將苦木潛在作用靶點導入Metascape 數據庫（http：//metascape.org/），設置屬性為“Homo Sapiens”，選擇Enrichment Analysis 進行基因本體論（Gene Ontology，GO）中分子功能Molecular Functions（GO-MF）、生物過程Biological Processes（GO-BP）、細胞成分Cellular Components（GO-CC）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析.

2.5 構建“苦木-靶標-疾病”網絡圖

將苦木潛在作用靶點導入比較毒性基因組學數據庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：//ctdbase.org/）進行疾病分析，將得到的靶標基因和對應的預測疾病導入Cytoscape 3.8.0 軟件構建“苦木-靶標-疾病”網絡圖，利用NetworkAnalyzer插件對網絡進行拓撲性質分析.再將獲得的靶點導入KEGG數據庫，在通路水平上全面揭示苦木的作用機制.

2.6 苦木靶標KEGG通路圖及癌細胞中表征預測

將靶點導入KEGG 數據庫（https：//www.genome.jp/kegg/），利用KEGG Mapper 分析工具查詢苦木靶標信號通路.同時在CBPortal 癌癥基因組數據庫（https：//www.cbioportal.org/）和人類蛋白圖譜（https：//www.proteinatlas.org/）數據庫中對苦木靶標表達情況進行預測表征.

2.7 苦木提取物的制備

用中藥粉碎機將清洗干燥后的苦木片進行粉碎，過篩，得到苦木粉末，準確稱取粉末25 g，量取65%的乙醇溶液200 mL，以料液比1∶8（g/mL）的比例配制提取體系.用超聲提取器震蕩提取1 h后進行真空抽濾.濾液使用旋轉蒸發儀濃縮后經真空凍干8 h，得到待用藥品.準確稱取40 mg 藥品溶于1 mL DMSO，即母液濃度為40 000 μg/mL，保存待用.

2.8 細胞培養

細胞復蘇后觀察其生長狀態，每兩天換液一次，待長至約八成滿棄去培養液，取適量PBS緩沖液潤洗，加少量酶液（覆蓋細胞瓶表面即可）酶解，顯微鏡下觀察至細胞收縮，細胞間間隙增大，棄去酶液.加適量培養基，對細胞進行輕輕吹打，混勻.將懸液分裝至新的細胞瓶，補足培養液（血清培養基比例=1∶9）.細胞培養瓶置于細胞恒溫培養箱，37 ℃、5% CO2，靜置培養.

2.9 MTT法檢測細胞的增殖抑制率

癌細胞接種：癌細胞制成單細胞懸液，吸取適量懸液使用血球計數板計數并計算細胞濃度，使用PRMI1640 細胞培養基調整濃度至5×104個/mL，每孔100 μL 接種于96 孔板上，PRMI164 細胞培養基作為空白對照，37 ℃、5% CO2，靜置培養24 h.待細胞貼壁后棄去孔內培養基，取苦木醇提藥物母液進行梯度稀釋，按照設計孔位加入濃度梯度的藥物，每孔100 μL設6個復孔.使藥物梯度終濃度為400 μg/mL，200 μg/mL，100 μg/mL，50 μg/mL，25 μg/mL，靜置培養24 h 后避光向各孔中加入20 μL MTT，避光孵育4 h，棄去溶液并加入DMSO 將結晶完全溶解后，在酶聯免疫檢測儀OD492處測量各孔的吸光值，并以藥物濃度為橫坐標、抑制率值為縱坐標，繪制生長抑制曲線.存活率=（苦木片醇提物處理組OD492-空白組OD492）/（溶液對照組OD492-空白組OD492）×100%.抑制率=1-存活率.采用SPSS 26.0統計軟件進行結果分析，所有統計數據均表示為三個獨立實驗的均數±標準差（xˉ±s）.

3 結果

3.1 苦木靶點預測及網絡構建

3.1.1 苦木化學成分庫構建和有效藥用活性成分篩選

通過大量文獻查閱與各中藥成分數據庫平臺檢索構建苦木的化學成分庫檢索，結果顯示苦木主要化學成分為生物堿類和苦味素類，共有7 種不同提取方法和53 種化學成分［5，8-12］（表1），且成分類型和檢測方法無明顯關系，而與提取溶劑有關，苦木脂溶性生物堿類和苦味素類主要由醇回流方式提取，而水溶性生物堿類和苦味素類報道甚少，所以本研究后續驗證實驗采用醇提取液.同時結合OB，DL 以及生物利用度等條件篩選預測到苦木中有效藥用成分為4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮、4，5-二甲氧基-鐵屎米酮、1-乙基-4，8-二甲氧基-β-咔巴啉、鐵屎米-6-酮和苦木內酯G.

表1 苦木的主要化學成分

3.1.2 苦木靶標預測及GO基因功能注釋和KEGG通路富集分析

將苦木的5個活性成分4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮、4，5-二甲氧基-鐵屎米酮、1-乙基-4，8-二甲氧基-β-咔巴啉、鐵屎米-6-酮和苦木內酯G 對應的SMILES（Simplified Molecular Input Line Entry System，簡化分子線性輸入系統）號導入Swiss target Prediction 平臺中進行靶點預測分析得到412個靶標蛋白，刪除103 個重復靶標蛋白后，得到309 個無重復映射活性成分潛在的作用靶點.將靶點導入Metascape數據庫中進行GO和KEGG通路富集分析，并以此來繪制GO和KEGG富集分析氣泡圖，圖中的橫坐標表示該基因占總基因的比值，縱坐標則表示該功能的名稱，圓圈的大小表示作用靶點基因富集的數目，富集的基因越多，其圓圈的大小也就會越大，顏色的深淺則表示基因富集的程度，即該基因富集的程度越好，顏色就越深（圖1）.

圖1 苦木潛在靶點GO基因功能注釋和KEGG通路富集氣泡圖

結果顯示GO-BP 主要包括突觸信號傳遞、蛋白質自我磷酸化、細胞遷移正向調節、細胞死亡正向調節、離子穩態、肽基-絲氨酸修飾和凋亡信號通路等.GO-CC 主要包括磷脂酰肌醇3-激酶復合體IA 類、γ-分泌酶復合體、細胞周期蛋白E1-CDK2 復合物、GABA-A 受體復合物、焦點粘著和肽復合體等.GO-MF主要包括跨膜受體蛋白激酶活性、蛋白質激酶活性、3′5′-環核苷酸磷酸二酯酶活性、G蛋白偶聯胺受體活性、天冬氨酸型內肽酶活性和蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等.上述苦木的活性成分相關靶標的GO 基因注釋功能與抗癌、阿爾茨海默癥存在聯系，如磷脂酰肌醇3-激酶復合體IA 類，它可以通過多方面來降低細胞死亡的頻率、增加腫瘤細胞的轉移以及新生血管的生成［13］，蛋白絲氨酸/蘇氨酸的異常表達可能與舌鱗狀細胞癌的發生有密切聯系［14］，γ-分泌酶復合物蛋白的斑塊沉積與阿爾茲海默癥的發病有著密切的聯系［15］.

KEGG富集通路主要包括癌癥中的轉錄錯誤調節、癌癥途徑、癌癥microRNAs、MAPK信號傳導途徑、炎癥介質對Trp 通道的調節、羥色胺能突觸、卵巢類固醇生成、膀胱癌和阿爾茨海默氏等，可以看出苦木預測的靶標KEGG 通路與抗癌相關，MAPK 信號通過可能與其他的通路一起被誘導激活從而誘導癌細胞的增殖轉移，MAPKs 和NF-κB 信號通道的衰減，可以通過減少自由基的形成來阻礙破骨細胞的生長［16］.癌癥中的microRNAs 也正在成為人類癌癥發生的新型信號因子［17］，而卵巢類固醇也與卵巢癌有著深刻聯系［18］.

3.1.3 苦木潛在靶標PPI網絡圖構建及核心靶點篩選

苦木預測靶標導入STRING 數據庫進行分析，得到蛋白互作PPI網絡圖，STRING 數據庫導出蛋白互作信息，篩選出得分前15 的蛋白作為Hub 蛋白（圖2）.其中關鍵靶點包括：病毒癌基因編碼酪氨酸蛋白激酶（Sarcoma gene，SRC，Degree=86）、可熱休克蛋白90α（HSP90AA1，Degree=82）以及絲裂原活化蛋白激酶家族（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）等.其中出現頻率高的靶點SRC［19］、 HSP90AA1［20］、 MAPK1［21］、 PIK3CA［22］、 FYN［23］、 CDK1［24］、 LCK［25］、 JUN［26］、MAPK14［27］、JAK2［28］、EGFR［29］、PTK2［30］、ABL1［31］、MAP2K1［27］、NR3C1［32］和MAPK8［27］參與了多種癌癥信號通路，包括MAPK 信號通路、細胞凋亡、細胞毒性、調節干細胞多能性、吞噬作用等信號通路，基本上涵蓋了癌癥/腫瘤的所有機制，表明這些靶點、信號通路可能在癌癥的發生發展中發揮重要作用.

圖2 苦木活性成分靶標的PPI網絡圖和中心Hub蛋白

3.1.4 苦木-靶點-疾病網絡圖構建

在CTD 數據庫中對苦木靶點進行疾病分析，將得到的靶標基因和對應的預測疾病導入Cytoscape 3.8.0軟件構建“苦木-靶點-疾病”網絡圖，利用Network Analyzer插件對網絡進行拓撲性質分析，在該圖示中，苦術位于中心位置并顯著突出，而作為靶點的部分以圓圈形式表示，疾病則以方形式標識.同時進行Degree 值分析，Degree 值越高表明苦木-疾病相關性越強，結果顯示苦木潛在靶標主要與消化道系統、呼吸系統以及生殖系統相關的癌癥疾病有關（圖3）.

圖3 苦木“藥物-靶標-疾病”網絡圖和疾病Degree值

3.1.5 苦木靶點信號通路及對癌細胞作用預測

將獲得的靶點導入KEGG 數據庫進一步在通路水平上全面揭示苦木的抗腫瘤作用機制.通路上所含基因產物（靶點）越多，苦木越有可能通過這些通路發揮作用，結果顯示苦木靶標相關的信號通路有腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、缺氧誘導因子-1（Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號通路、核轉錄因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路等，這165條關鍵通路的生物學功能可以分為4 個主要調節模塊：促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤增生、免疫調節、內分泌調節、血液循環系統調節（圖4）.

圖4 苦木靶標KEGG通路預測圖

通過cBioPortal（https：//www.cbioportal.org/）數據庫分析顯示苦木靶標蛋白SRC、HSP90AA1、MAPK1、PIK3CA、FYN、CDK1、LCK、JUN、MAPK14、JAK2、EGFR、PTK2、ABL1、MAP2K1、NR3C1和MAPK8在子宮癌、非小細胞肺癌和食道癌等細胞系中表達較為顯著（圖5）.

圖5 苦木靶標基因在不同細胞系中的表達預測

3.2 藥理活性體外驗證

3.2.1 宮頸癌C33A細胞增殖檢測

苦木藥物濃度梯度作用于宮頸癌C33A 細胞24 h 后檢測分析，結果顯示宮頸癌C33A 細胞增殖抑制率與苦木濃度呈正相關，隨著苦木藥物濃度升高，宮頸癌C33A 細胞增殖的抑制率逐漸升高，尤其在苦木濃度升至100 μg/mL時，宮頸癌C33A細胞增殖抑制率尤為顯著.同時宮頸癌C33A細胞形態也隨著苦木濃度的增加由正常緊密分布的立體梭形逐漸皺縮變形，并伴隨著明顯的細胞間隙增大（圖6）.

圖6 苦木對宮頸癌C33A細胞生長的影響

3.2.2 食道癌ECA-109細胞增殖檢測

苦木藥物濃度梯度作用于食道癌ECA-109 細胞24 h 后，觀察細胞狀態，并計算細胞增殖的抑制率.結果顯示隨著苦木藥物濃度的升高，各濃度苦木處理的食道癌ECA-109細胞增殖的抑制率逐漸升高，且在低濃度（25 μg/mL）時表現出較強的癌細胞抑制顯著性.隨著苦木濃度的增加，食道癌ECA-109 細胞形態也從正常梭形逐步變圓脫落，且在苦木高濃度（400 μg/mL）作用下出現邊界不清晰至細胞膜破裂的現象（圖7）.

3.2.3 人非小細胞肺癌A549細胞增殖檢測

苦木藥物濃度梯度作用于人非小細胞肺癌細胞A549，結果可看出人非小細胞肺癌A549 與上述兩種癌細胞呈現出同樣的抑制趨勢，即隨著苦木濃度的升高，細胞生長也受到了顯著抑制，細胞生長抑制率與苦木濃度呈現顯著正相關關系.人非小細胞肺癌細胞A549 的細胞形態在苦木作用下也由正常逐漸皺縮至出現明顯胞質空泡化（圖8）.

圖8 苦木對人非小細胞肺癌細胞A549生長的影響

4 討論

本研究首先利用數據挖掘和文獻檢索確定了苦木的53 種化學成分，經過在TCMSP，TCMIP 以及Swiss ADME 數據庫中對苦木化學成分進行口服利用度和藥物相似性等原則篩選后，最終明確了苦木的有效藥用成分為4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮、4，5-二甲氧基-鐵屎米酮、1-乙基-4，8-二甲氧基-β-咔巴啉、鐵屎米-6-酮和苦木內酯G.經網絡藥理學及生物信息學對苦木活性成分的靶點進行收集分析，通過檢索Swiss Target Prediction 數據庫，獲得無重復映射潛在作用靶點309 個.將這些靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析和蛋白互作PPI，結果均顯示苦木的靶標可能參與癌癥相關信息通路.進一步在CTD數據庫中挖掘結果表明苦木可能與消化道系統，呼吸系統以及生殖系統相關的癌癥疾病有交聯，前期研究也指出苦木是臨床上用于治療腸胃疾病、過敏性哮喘和泌尿生殖炎癥的中藥［33-35］.在CBPortal 數據庫中檢索，結果將苦木相關的癌細胞系聚焦到了子宮癌、非小細胞肺癌和食道癌等細胞系中.

體外實驗結果顯示，苦木對宮頸癌C33A細胞、人食道癌細胞ECA-109和人非小細胞肺癌A549的生長抑制呈現顯著的濃度依賴性.對上述三種細胞系添加不同濃度苦木藥物，其中人食道癌細胞ECA-109 和人非小細胞肺癌A549 在苦木呈低濃度（25 μg/mL）時，就出現了顯著抑制現象，隨著濃度梯度增加至400 μg/mL，細胞逐漸皺縮脫落及空泡化.苦木對人宮頸癌C33A 細胞同樣也有生長抑制作用，但是相比于其他兩種細胞系，宮頸癌C33A 細胞的最低抑制閾值偏高，即在苦木濃度為50 μg/mL 時出現抑制現象，濃度高于100 μg/mL 后抑制尤為顯著.金永哲等對苦木的醇提液也進行了肺癌細胞的抑制作用研究，結果顯示苦木降低了肺癌細胞A549、A549/PTX 和QSG-770 的增殖及遷移能力，引起細胞發生凋亡［36］.此外，也有報道發現苦木醇提物通過降低H-Ras 表達，誘導肝癌細胞HepG2 的凋亡［37］，其抗腫瘤活性可能與4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮有關［38］.苦木正丁醇提取物誘導HT-29結腸和NCI-N87胃癌細胞凋亡.重要的是，這些提取物對293T正常人類細胞沒有細胞毒性［39］.

前期關于苦木的研究多聚焦于其成分、抗炎、抗菌和抗氧化等方向［6-7］，抗腫瘤方向研究甚少，且多側重于其具體成分具體功效分析.本研究通過多數據庫多角度多維度首先推測苦木的可能功效為抗腫瘤，進一步確定其作用候選細胞系為子宮癌、非小細胞肺癌和食道癌等，通過體外試驗也證實了上述推測.同時通過KEGG 通路圖預測，本研究也提出苦木可能的抗腫瘤分子機制為TNF、MAPK、HIF-1 和NF-κB 信號通路.對SHR 大鼠灌胃苦木，發現其血清中TNF-α 顯著降低［7］.苦木中的苦木西堿顯著抑制破骨細胞的轉錄因子c-Fos 和NFATc1，阻止MAPKs 和NF-κB 信號通路，進而抑制破骨細胞形成［40］.苦木的其他抗腫瘤活性相關通路多聚焦于苦木中的有效成分，如張琳等發現苦木中苦木堿F 通過miR-331-3p/PSME3 軸抑制宮頸癌HeLa 細胞的增殖［41］.苦木β-咔巴啉生物堿通過增強細胞外調節蛋白激酶ERK 和Janus 蛋白激酶JNK 磷酸化來誘導人鼻咽癌細胞系凋亡，該研究也首次提出人鼻咽癌中p-JNK和p-REK 的直流磷酸化誘導途徑［42］.同時苦木西堿I通過ERK和Akt信號通路調節HO-1，在鼻咽癌中發揮抗癌作用［43］.苦木β-咔啉-3-羧酸乙酯（β-CCE）通過增加細胞內ROS 水平來激活p38/MAPK 信號通路隨后誘導宮頸癌SiHa 細胞的凋亡［44］.苦木β-咔啉生物堿（+/-）-Kumudine A-D 也可以影響肝癌細胞Hep3B 和HepG2 的生長［45］.遺憾的是，迄今沒有關于苦木與HIF-1 信號通路相關性的研究報告，所以苦木的抗癌HIF-1信號通路是后期的重點關注方向.

本研究將數據挖掘和網絡藥理學應用到中藥研究思路中，突破了中藥藥理研究的傳統固有思路，多成分多靶點多途徑多維度整合聚焦具體疾病，實現經驗到理性的科學化進程，以期對苦木研究提供用藥可能性和更充分更有說服力的理論基礎.