凡納濱對蝦血藍蛋白大亞基啟動子的克隆及鑒定

郭麗釩，黃賀楠，趙瓊君，張涵，楊昊，楊培奎?

（1.韓山師范學院 生命科學與食品工程學院，廣東 潮州 521041；2.潮安歸湖偉興淡水養殖有限公司，廣東 潮州515653）

1 引言

水產養殖業是人類重要的動物蛋白質來源，其中凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）作為一種重要的對蝦養殖品類在全球有著廣泛的分布和養殖，據FAO 統計凡納濱對蝦全球年產量在2019年超過468萬噸［1］.我國是目前全球對蝦養殖產量最高的國家，其中凡納濱對蝦是產量最高的對蝦養殖品類之一.雖然近20年來對蝦養殖業快速發展，但是以肝胰腺壞死綜合征和白斑綜合征為代表的細菌性病害和病毒性病害，以及種苗質量和養殖環境等一系列問題，制約著對蝦養殖業的健康可持續發展.

由于缺乏適應性免疫系統，對蝦主要依賴由細胞和體液組成的先天免疫系統抵御病原微生物的入侵［2-4］.因此，對蝦的先天免疫系統越來越多地為國內外的研究人員所關注.值得注意的是，血藍蛋白是近年來在對蝦等無脊椎動物中新發現的一種多功能免疫分子，其具有抗病毒、抑菌、凝集、溶血和抗腫瘤等多種免疫學活性［5-9］，其功能多樣性的分子機制可能與其在核酸水平的單核苷酸多態性、轉錄變體和選擇性剪切等有關［10-14］.這些研究提示，闡明血藍蛋白的轉錄調控機制，對進一步揭示血藍蛋白在對蝦免疫防御中的作用具有重要意義.

為此，本研究以具有多種變體以及在對蝦基因組中具有多個基因座的凡納濱對蝦血藍蛋白大亞基基因為研究對象，在獲取血藍蛋白大亞基啟動子候選序列的基礎上，對其調控核心區及其參與調控的轉錄因子進行研究，為進一步完善血藍蛋白大亞基基因參與免疫防御的分子機制奠定基礎.

2 材料和方法

2.1 材料和試劑

凡納濱對蝦（體重5-10 g）由潮安歸湖偉興淡水養殖有限公司提供.DH5α感受態細胞和293T細胞均為本實驗室保存，熒光素酶報告質粒pGL 3-Basic和內參質粒pRL-TK為本實驗室保存.

海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒、無內毒素質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；DNA 膠快速回收試劑盒、DNA 片段純化試劑盒、DNA Marker D5000購自北京康潤誠業生物科技有限公司；PrimeSTAR Max Premix、DNA Ligation Kit Ver.2.1、限制性內切酶Quick CutTMKpn I、Quick CutTMXho I 購自Takara 公司；DMEM 培養基和胎牛血清購于Thermo fisher（美國）公司；TransDetect?Double-Luciferase Reporter Assay Kit 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；轉染試劑Lipo6000?購自碧云天生物技術有限公司.

2.2 凡納濱對蝦血藍蛋白大亞基基因（PvHMCL）候選啟動子序列克隆

根據凡納濱對蝦基因組中血藍蛋白大亞基基因（GenBank：ROT60816.1）的候選啟動子序列設計引物HLP2-F/R（引物序列見表1）擴增獲得血藍蛋白大亞基基因起始密碼子上下游序列HLP2 片段.生物信息學分析及雙熒光素酶報告分析表明HLP2片段序列正確且包含啟動子片段，以HLP2序列為模板設計4 條上游引物（HLP2-1F、HLP2-2F、HLP2-3F、HLP2-4F）以及HLP2-5F/R 遞減擴增啟動子去片段（引物序列見表1）.所有上游引物引入Kpn I限制性酶切位點及保護堿基，下游引物引入Xho I酶切位點及保護堿基，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成.PCR 擴增體系為20 μL：Prime-STAR Max Premix：10 μL，上下游引物各1 μL，基因組DNA：1 μL；H2O：7 μL（補足至20 μL）.PCR 反應條件：96 ℃預變性3 min；96 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環；72 ℃最終延伸10 min；4 ℃保存.將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產物回收純化后進行Kpn I 和Xho I 雙酶切，經酶切產物回收，利用T4 DNA 連接酶連接后，定向克隆同樣雙酶切的pGL3 basic 載體中構建pGL3-HLP2 雙熒光素酶報告基因質粒.連接產物轉化DH5α 感受態細胞，挑選陽性單克隆菌落，并由北京六合華大基因科技有限公司鑒定.

表1 擴增凡納濱對蝦血藍蛋白大亞基啟動子序列的引物

2.3 凡納濱對蝦血藍蛋白大亞基基因啟動子（HLP2）序列生物信息分析

利用在線軟件Promoter-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/Promoter-2.0/）對HLP2序列進行轉錄起始位點預測.利用在線軟件FPROM （http：//www.softberry.com/berry.phtml?topic=fprom&group=programs&subgroup=promoter）預測TATA-box.使用JASPAR 數據庫（https：//jaspar.genereg.net/）、TFBIND （https：//tfbind.hgc.jp/）、Match （http：//gene-regulation.com/pub/programs.html#match）、PROMO（https：//alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3）等在線軟件對核心啟動子區內潛在轉錄因子結合位點進行預測；利用MethPrimer（http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）在線軟件對HLP2啟動子區域進行CpG島預測.

2.4 凡納濱對蝦血藍蛋白大亞基基因啟動子（HLP2）報告基因載體構建及鑒定

將PCR 擴增得到的對蝦血藍蛋白大亞基啟動子遞減長度的片段同樣經過Kpn I 和Xho I 雙酶切回收后，利用T4 DNA 連接酶連接后，定向克隆同樣雙酶切的pGL3 basic 載體中，分別構建HLP2 的截短雙熒光素酶報告基因質粒pGL3-HLP2-1（-762/+735 bp）、pGL3-HLP2-2（-356/+735 bp）、pGL3-HLP2-3（+87/+735 bp）、pGL3-HLP2-4（+300/+735 bp）和pGL3-HLP2-5（+87/+321 bp）.

2.5 細胞轉染和雙熒光素酶報告基因檢測

接種293T 細胞于24 孔板中，添加含有10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM 培養基，每個孔的細胞接種量為5×105個細胞，置于37 ℃，CO2濃度為5%的培養箱中培養至細胞匯合度為70%-80%時，將構建的重組雙熒光素酶報告質粒按照Lipo6000?脂質體的操作要求轉染至293T 細胞，作為試驗組.同時將pGL3 basic轉染至293T細胞作為陰性對照組，以pRL-TK 作為內參質粒同時轉染至上述細胞，試驗重復3 次，每組3 個平行試驗.在質粒瞬時轉染48 h 后，收集細胞裂解液，根據雙熒光素酶檢測試劑盒TransDetect?Double-Luciferase Reporter Assay Kit（北京全式金生生物技術有限公司）的操作要求分別測定并計算螢火蟲熒光素酶活性（F值）和海腎熒光素酶活性（R值）的比值（F/R）確定啟動子片段相對活性.

3 結果

3.1 對蝦血藍蛋白大亞基啟動子（HLP2）片段的擴增

以蝦肌肉基因組DNA 為模板，通過PCR 擴增獲取血藍蛋白大亞基基因的候選啟動子片段HLP2，PCR擴增產物經凝膠電泳檢測結果顯示（圖1），該擴增片段與目的片段的大小一致，且條帶單一、無明顯雜帶.經測序鑒定，擴增片段長度為1 964 bp，其中包括起始密碼子ATG 上游1 229 bp，下游735 bp，與凡納濱對蝦基因組序列中血藍蛋白大亞基的序列比對完全一致，可用于后續試驗.

圖1 HLP2啟動子候選序列PCR擴增產物電泳圖

3.2 對蝦血藍蛋白大亞基啟動子（HLP2）核心區鑒定

以HLP2片段為模板，利用缺失引物進行PCR擴增分別獲取HLP2的逐段缺失啟動子區片段HLP2-1、HLP2-2、HLP2-3、HLP2-4、HLP2-5和HLP2-6，并將上述片段分別定向克隆只pGL3-basic載體.經測序和雙酶切（圖2）鑒定，成功構建HLP2及其缺失片段的雙熒光素酶報告基因重組質粒，將其分別命名為pGL3 HLP2、pGL3 HLP2-1、pGL3 HLP2-2、pGL3 HLP2-3、pGL3 HLP2-4 和pGL3 HLP2-5（圖3-A）.

圖2 HLP2基因啟動子截短型報告基因質粒酶切鑒定

圖3 HLP2候選啟動子核心區分析

將上述質粒利用脂質體瞬時轉染至293T 細胞，通過雙熒光素酶報告基因分析逐段缺失片段的啟動子活性發現（圖3-B），HLP2（-1 235/+735 bp）啟動子片段的活性較低，進一步對缺失區域進行比較發現，缺失-1 235/-357 bp 片段后，缺失啟動子片段HLP2-2（-365/+735 bp）的活性相比較HLP2 和HLP2-1（-762/+735 bp）分別顯著上調330%和300%（P<0.01）.進一步缺失-365/+86 bp 片段后的HLP2-3（+87/+735 bp）的啟動子活性進一步增強.然而，缺失+87/+299 bp片段后的HLP2-4（+300/+735 bp）的啟動子活性相比較HLP2-3 顯著下降88.9%（P<0.01）.進一步分析發現HLP2-5（+87/+300 bp）片段的啟動子活性顯著高于HLP2和HLP2-3片段的啟動子活性，由此確定+87/+300 bp區域為對蝦血藍蛋白大亞基啟動子（HLP2）的核心區.

3.3 對蝦血藍蛋白大亞基啟動子（HLP2）生物信息學分析

利用Promoter-2.0在線程序預測HLP2的轉錄起始位點（TSS），結果表明HLP2在+66 bp的位置存在一個轉錄起始位點（圖4）.通過FPROM 在線軟件分析可知，HLP2啟動子區具有典型的真核生物啟動子結構原件，含有1個TATA-box（圖4）.利用Match?-1.0、PROMO、JASPAR 和TFBIND 等多個在線軟件對HLP2啟動子核心區域（HLP2-5，+87/+300 bp片段）的關鍵轉錄因子進行預測.結果顯示，HLP2-5 啟動子區域包含KLF1、KLF4、KLF5、YY1、c-Jun、AP1、AP4、USF、CP2、DP-1 和DELTAEF1等轉錄因子的結合位點（圖4）.因此初步推測，上述轉錄因子可能參與對蝦血藍蛋白大亞基基因的轉錄調控.

圖4 HLP2啟動子基因核心區轉錄因子結合位點預測

利用在線軟件MethPrimer 對凡納濱對蝦血藍蛋白大亞基基因啟動子HLP2（-1 234～+735 bp）進行CpG 島預測，結果表明，啟動子序列HLP2 在-312/+725 bp 處存在一個CpG 島（圖5）.通過EMBOSS Cpgplot預測，結果同樣發現HLP2啟動子片段在-312/+725 bp處存在一個CpG島（圖6）.兩種在線程序對凡納濱對蝦血藍蛋白大亞基基因啟動子區CpG島的預測結果一致.

圖5 HLP2的CpG島預測（MethPrimer）

圖6 CpG島預測結果（EMBOSS：Cpgplot）

4 討論

由于缺乏適應性免疫系統，因此對蝦主要依賴先天免疫系統抵御病原微生物的感染.研究表明，對蝦的免疫系統由細胞免疫和體液免疫組成，其中體液免疫包括多種免疫相關基因（如抗菌肽、蛋白酶及其抑制劑、酚氧化酶原系統、模式識別受體和細胞凋亡相關基因等）和信號通路（Toll、IMD和JAK/STAT等）［15-17］.有趣的是，血藍蛋白作為一種存在于節肢動物和軟體動物體液中的含銅呼吸蛋白，近年來的研究表明除了攜氧功能植物，血藍蛋白還具有酚氧化酶、抗病毒和抗菌等多種免疫活性［7，14，18-20］，同時也參與對蝦免疫信號的通路調控［21-23］.此前的研究表明，凡納濱對蝦血藍蛋白是由3 個大亞基和3 個小亞基組成的6 聚體［7，14］.Yang［24-25］等在克隆凡納濱對蝦血藍蛋白小亞基基因啟動子的基礎上進一步發現c-Jun、Kruppel 等轉錄因子參與小亞基啟動子的轉錄調控.與此同時，Zhang［26］等也證實轉錄因子E75參與對蝦血藍蛋白小亞基啟動子的負調控.雖然，此前的研究表明血藍蛋白大亞基具有更多的變體［11］及SNP位點［27］且與病原感染后的免疫應答密切相關，同時凡納濱對蝦基因組的數據表明基因組中存在多個大亞基基因的基因座.因此，本研究對凡納濱對蝦血藍蛋白大亞基基因啟動子區序列進行了克隆與分析，篩選出核心啟動子區并對該區域的轉錄因子結合位點進行預測，為進一步分析其轉錄調控機制奠定基礎.

本研究以凡納濱對蝦基因組中血藍蛋白大亞基的序列為基礎設計引物，通過PCR 技術擴增得到HLP2基因包括起始密碼子ATG，及其上游序列735 bp，下游序列1 234 bp在內的全長1 969 bp的基因組DNA 片段.生物信息學分析發現，該區域包括TATA-box 轉錄調控元件，轉錄起始位點，因此將其作為啟動子候選序列片段.在此基礎之上，通過亞克隆將一系列啟動子載體構建，進行啟動子活性及其核心區的分析.結果表明，pGL3 HLP2-3的啟動子活性明顯高于全長片段的啟動子活性，然而在刪除+87/300 bp 之后啟動子活性顯著下降，而HLP2-5（+87/300 bp）片段的啟動子活性明顯高于HLP2 和HLP2-3 等片段的啟動子活性.由此提示，這是HLP2 啟動子一個位于外顯子的核心區域.目前，已有許多關于啟動子位于外顯子的研究報道，如，hDAO在外顯子2中存在一個選擇性啟動子［28］，MAPT（microtubule-associated protein tau gene）基因在外顯子1 中存在選擇性啟動子［29］，WNT5A（Wnt family member 5A gene）的選擇性啟動子B 位于外顯子2［30］.由此，位于外顯子1的HLP2核心啟動區可能為一個選擇性啟動子，與目前人們在人類基因組中發現30%-50%的人類基因存在選擇性啟動子的結論相似［31］.而此前血藍蛋白小亞基基因啟動子中同樣發現一個位于內含子和外顯子的核心調控區域［24］.另外，有研究指出p53基因位于內含子4 的一個內部啟動子可轉錄編碼多個不同的p53轉錄本［31-32］.值得一提的是，血藍蛋白大亞基具有多種轉錄本，血藍蛋白大亞基的選擇性啟動子可能與不同轉錄本的產生有關.

綜上所述，本研究成功克隆了凡納濱對蝦血藍蛋白大亞基基因啟動子HLP2 序列，并進行生物信息學分析發現其存在TATA-box轉錄元件、轉錄起始位點和CpG島.同時，構建HLP2啟動子熒光素酶報告基因載體，利用雙熒光素酶鑒定得到一個位于外顯子1的（+87/+300 bp）核心區域，并對核心區域的轉錄因子結合位點進行預測，至于相關轉錄因子對HLP2的轉錄調控尚需進一步驗證和深入研究.