高濃度磷酸鹽緩沖液中多巴胺電化學氧化過程的在線質譜分析

林嘉美,王昊天,李 慧,余振東,宋麗麗,朱玉玲,徐加泉

(東華理工大學,江西省質譜科學與儀器重點實驗室,江西 南昌 330013)

電化學-質譜聯用技術是研究電化學反應機理的重要技術手段[1]。由于質譜技術具有檢測靈敏度高、檢測通量大、特異性好,可同時獲得多種組分的定性、定量信息等優點,在電化學反應產物監測和中間體捕獲鑒定中有著重要應用。目前,采用電化學-質譜聯用技術可以實現電化學反應過程中氣相及揮發性產物[2-3]、液相產物[4-5]、短壽命中間體[6-7]等不同組分的分析,在電催化和電化學反應機理研究中獲得了廣泛應用[8-9],但是在研究電化學反應過程中仍存在挑戰,如溶液介質匹配性問題[10]。在電化學反應中,通常需要使用的電解質鹽不僅會凝結在質譜進樣口,導致進樣口堵塞,而且還會抑制目標物的質譜信號,或與目標物形成加合離子,使譜圖更復雜,增加了分析難度[11],給質譜分析帶來不利影響。為克服這一問題,一般使用低濃度電解質鹽或不使用電解質鹽,其次使用CH3COONH4等低沸點電解質鹽,但這與實際電化學反應體系存在差異。因此,發展一種可實時在線獲取高濃度緩沖鹽溶液中痕量有機組分的質譜分析方法,對于研究電化學過程具有重要意義。

目前,針對如何獲取高濃度鹽溶液中有機組分的質譜信號,研究者們開發了一些可行方法。黃光明等[12]發展了誘導納升電噴霧電離質譜(induced nanoelectrospray ionization mass spectrometry)法,通過在納升電噴霧電離源針尖外壁施加脈沖直流高壓電,以誘導電離的方式實現高濃度鹽溶液中有機物分子的高靈敏分析,但進樣量較小,目前還未應用于高流速在線分析中。徐靜娟等[13]通過縮小納升電噴霧電離源針尖尺寸,有效克服了無機鹽對待測產物質譜信號的影響,但較小的尖端尺寸易被無機鹽堵塞,不適合長時間的在線分析。白玉等[15]在萃取電噴霧電離技術(EESI)[14]的基礎上發展了一種雙槍式萃取電離方式,實現了緩沖鹽溶液中單細胞的檢測,但譜圖中仍可觀察到明顯的無機鹽團簇峰。潘遠江等[16]基于熱沉積原理將無機鹽組分沉積在加熱板上,有機組分則揮發出來進入質譜檢測,實現了高濃度無機鹽溶液中痕量有機組分的分析,但經加熱基底反射后易導致樣品損失,使進入質譜進樣口的組分有限,因此需要較大的流速(50 μL/min～2 mL/min),難以實現微量液體中組分的分析。

基于此,本研究擬發展一種可在線分析高濃度緩沖鹽溶液中痕量有機組分的大氣壓化學電離質譜(APCI-MS)法,結合自主研制的微型流動電解池,構建可在線分析高濃度緩沖鹽溶液中電化學過程的電化學-質譜裝置,并以常見的多巴胺氧化過程為研究對象,根據質譜分析數據,驗證緩沖鹽體系中多巴胺的電化學氧化過程機理。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

LTQ-XL線性離子阱質譜儀:美國Thermo Fisher Scientific公司產品,配有Xcalibur數據處理系統;MS105DU電子分析天平:瑞士梅特勒-托利多集團公司產品;CHI660e電化學工作站:上海辰華儀器有限公司產品。

1.2 主要材料與試劑

鹽酸:分析純,國藥集團化學試劑有限公司產品;磷酸緩沖鹽(1×PBS,含1.8 mmol/L KH2PO4、8 mmol/L Na2HPO4、137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl):分析純,北京索萊寶科技有限公司產品;鹽酸多巴胺:默克化工技術有限公司產品;聚二甲基硅氧烷(PDMS):陶氏(上海)投資有限公司產品;超純水(電阻率18.2 MΩ·cm):由美國Thermo Fisher Scientific公司生產的Nanopure超純水系統制得;鉑絲:直徑分別為0.5、0.2 mm,純度99.99%;銀絲:直徑0.2 mm,純度99.99%;AMPEEK63四通:AMICROM科學實驗室產品;石英毛細管(內徑0.1 mm):安捷倫科技有限公司產品。

1.3 實驗條件

1.3.1溶液配制 稱取適量的鹽酸多巴胺粉末,用0.1 mmol/L鹽酸溶液配制成1 mmol/L多巴胺鹽酸溶液,備用。量取1 mmol/L多巴胺鹽酸溶液,用1×PBS溶液配制成0.1 mmol/L多巴胺1×PBS溶液。

1.3.2質譜條件 正離子模式,質量掃描范圍m/z50～500,離子源電壓3 kV,離子傳輸管溫度275 ℃,毛細管電壓39 V,透鏡電壓60 V,霧化氣(氮氣,99.99%)壓強0.4 MPa。其他參數由系統自動優化產生。

1.4 實驗過程

1.4.1微型流動電解池的構建 該電解池為三電極體系,工作電極為鉑黑修飾的鉑絲(直徑0.5 mm),輔助電極為鉑絲(直徑0.2 mm),參比電極為Ag/AgCl。工作電極制備方法:采用三電極體系,以直徑0.5 mm鉑絲為工作電極,直徑0.2 mm鉑絲為輔助電極,Ag/AgCl為參比電極,采用i-t法施加-1 V恒電位,在0.5 mmol/L氯鉑酸溶液中沉積200 s。參比電極制備方法:采用兩電極體系,以銀絲為工作電極,鉑絲為輔助電極,在1 mol/L鹽酸溶液中采用循環伏安法(掃描范圍0～1 V,掃描速率0.1 V/s,循環次數20圈)進行制備,制備好的Ag/AgCl電極表面呈棕黑色。將制得的鉑黑修飾的鉑絲工作電極插入四通裝置的一端,參比電極Ag/AgCl和輔助電極鉑絲一起插入四通裝置的另一端,且兩電極之間通過塑料管隔離,四通的另外兩端則分別為電解液的入口和出口,示于圖1。

注:1.多巴胺磷酸鹽緩沖液;2.進樣泵;3.流動電解池;4.氣動霧化器;5.玻璃管;6.電阻絲;7.放電針;8.質譜進樣口圖1 電化學-大氣壓化學電離質譜聯用技術在線監測電化學反應示意圖Fig.1 Schematic illustration of on-line monitoring of electrochemical reaction by electrochemical atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry

1.4.2電化學過程分析 采用圖1裝置,用內徑0.1 mm的毛細管將自制的三電極流動電解池與氣動霧化裝置連接,氣動霧化器的噴口正對加熱管的一端,加熱管由玻璃管和纏繞其外面的加熱電阻絲組成(溫度230 ℃,長度2.5 cm)。在距加熱管出口5 mm處放置1根放電針,放電針距質譜進樣口1 cm,加熱管管口、放電針針尖、質譜進樣口三者平行。用蠕動泵進樣,使含有目標分子的緩沖鹽溶液以2 μL/min流經電解池,目標分子在工作電極上發生電化學反應后繼續流向氣動霧化裝置,在霧化氣(氮氣,0.4 MPa)輔助下形成噴霧,然后進入加熱管,通過熱沉積作用使無機鹽組分沉積在管壁,待測組分通過加熱管在管口經大氣壓化學電離后進入質譜檢測。

2 結果與討論

2.1 流動電解池的構建及表征

構建一個結構簡單、體積小、電化學性能優異的流動電解池,對于采用電化學-質譜技術研究電化學反應非常重要。本研究以常見的四通裝置作為流動電解池的基礎結構,四通的左右兩端分別作為電解液的進口和出口,四通的上端插入鉑黑修飾的鉑絲作為基礎工作電極,下端插入Pt和Ag/AgCl分別作為輔助電極和參比電極,并用PDMS對電極進行固定,形成一個結構簡單、體積小(約1 μL)的三電極流動電解池。為增加多巴胺與工作電極的接觸面積,實驗中Pt工作電極的尺寸為0.5 mm,電極尖端橫貫整個流體通道,但不與輔助電極和參比電極接觸。為獲得良好的電化學性能,本研究借助鉑黑納米顆粒對多巴胺的電化學催化性能[17],采用電化學沉積方式,在Pt工作電極表面沉積鉑黑納米顆粒。隨后,對流動電解池的電化學性能進行表征,將0.1 mmol/L多巴胺1×PBS溶液通過蠕動泵,以2 μL/min流過電解池,起始電位為-0.4 V,掃描范圍為-0.4～0.6 V,掃描速率為0.01 V/s,循環次數為5,該流動狀態下的多巴胺循環伏安圖示于圖2?？梢钥闯?在流動電解池中多巴胺循環伏安圖呈“S”型,具有明顯的氧化還原峰,這與流動電解池中物質傳質速度快有關,表明該流動電解池具有死體積小、電化學性能優異等特點。

圖2 流動電解池中多巴胺的循環伏安圖Fig.2 Cyclic voltammetry of dopamine in flow electrolytic cell

2.2 在線除鹽電離裝置的搭建及表征

為表征該裝置的性能,本研究配制了0.1 mmol/L多巴胺1×PBS溶液,以2 μL/min進樣,采用電噴霧質譜(ESI-MS)進行分析,結果示于圖3a。0.1 mmol/L多巴胺水溶液的ESI-MS譜圖示于圖3b,相比之下,圖3a的信號峰非常復雜,存在很多無機鹽團簇信號峰,多巴胺的特征峰m/z154[M+H]+不明顯,表明傳統的ESI-MS法難以實現高濃度緩沖鹽中有機組分的高靈敏檢測。隨后,采用本研究方法以同樣流速分析多巴胺緩沖液,結果示于圖3c,可見,存在明顯的多巴胺質子化信號m/z154[M+H]+。通過串聯質譜對該信號峰進行確認,示于圖3d,可觀察到明顯的m/z137碎片離子,為m/z154中性丟失NH3形成的。m/z137的串聯質譜圖示于圖3e,可觀察到失去1分子H2O(M-18)形成的m/z119碎片離子,失去CO或C2H4(M-28)形成的m/z109碎片離子,以及經多步裂解和重排形成的m/z91芐基離子。在此基礎上,依次分析了含0.1 mmol/L多巴胺10×PBS、0.1 mol/L NaCl和0.1 mol/L KCl的多巴胺溶液,其結果分別示于圖3f、3g、3h,圖中均可觀察到明顯的多巴胺質子化信號m/z154[M+H]+。以上結果表明,本方法可實現高濃度緩沖鹽溶液中有機組分的高靈敏分析。采用圖1裝置對0.1 mol/L多巴胺1×PBS溶液連續分析12 min前、后的加熱玻璃管實物圖示于圖3i,分析后的玻璃管壁沉積大量白色物質;當連續分析1 h后,會導致玻璃管堵塞,堵塞后的玻璃管可通過水清洗或更換玻璃管進行處理。此外,本裝置的另一優勢是電化學反應裝置和電暈放電裝置在空間上物理隔絕,電離過程所施加的高電壓不會對電化學過程產生影響,對于準確研究電化學反應過程至關重要。

注:a.0.1 mmol/L多巴胺1×PBS溶液的ESI-MS譜圖;b.0.1 mmol/L多巴胺水溶液的ESI-MS譜圖;c.0.1 mmol/L多巴胺1×PBS溶液的APCI-MS譜圖;d.圖c中m/z 154的MS2譜圖;e.圖d中m/z 154的MS3譜圖;f.0.1 mmol/L多巴胺10×PBS溶液的APCI-MS譜圖;g.0.1 mmol/L多巴胺-0.1 mol/L NaCl的APCI-MS譜圖;h.0.1 mmol/L多巴胺-0.1 mol/L KCl的APCI-MS譜圖;i.分析前、后加熱玻璃管照片圖3 多巴胺磷酸鹽緩沖液的質譜分析結果Fig.3 MS results of dopamine in PBS

2.3 多巴胺電化學反應在線監測

在流動電解池裝置和在線除鹽質譜分析裝置搭建完成后,將其用于多巴胺的電化學氧化反應過程研究。根據圖2的多巴胺循環伏安曲線,選取了0、0.3、0.6 V 3個電壓,分別對應多巴胺氧化過程的不同階段。實驗中,以0.1 mmol/多巴胺1×PBS溶液為研究對象,流速2 μL/min。氧化電位為0.6 V時的質譜圖示于圖4a,與圖3c對比可以發現,施加氧化電壓后,譜圖中出現了明顯的m/z150、303信號峰,可能為多巴胺的氧化產物。m/z303的串聯質譜分析結果示于圖4a插圖,出現了2個明顯的m/z154和150碎片離子。根據文獻[18-19]報道,多巴胺經過多步氧化可先后形成多巴醌、多巴色素、聚多巴胺等。為此,推測m/z154和150分別為多巴胺(MW=153)和多巴色素(MW=149)的質子化信號[M+H]+。采用串聯質譜進一步確定這2個碎片離子,m/z154的串聯質譜結果與圖3d～3e一致,確認其為多巴胺的質子化信號。m/z150的串聯質譜分析結果示于圖4b～4d,可見m/z150丟失CO形成m/z122碎片離子,繼續丟失CO形成m/z94碎片離子,再丟失HCN形成m/z67碎片離子。以上結果證實了m/z150為多巴色素的質子化信號峰,m/z303為多巴胺和多巴色素形成的加合物質子化信號。在0、0.3、0.6 V氧化電壓下,m/z150和303的選擇離子流(EIC)信號分別示于圖4e、4f。在氧化電壓0 V下,沒有觀察到m/z150和303質譜信號;在氧化電壓0.3 V下,可觀察到明顯的m/z150、303質譜信號;在氧化電壓0.6 V下,m/z150和303質譜信號進一步增強,與循環伏安結果一致。

注:a.氧化電位0.6 V時的多巴胺質譜圖;b.m/z 303的MS2譜圖;c.m/z 303的MS3譜圖;d.m/z 303的MS4譜圖;e.不同氧化電位下m/z 150的離子流圖;f.不同氧化電位下m/z 303的離子流圖圖4 多巴胺電化學-質譜分析結果Fig.4 Electrochemical mass spectrometry results of dopamine

根據本研究結果,提出了多巴胺在該氧化條件下的電化學反應過程,示于圖5。首先,多巴胺在電極表面發生氧化,失去4個電子和4個氫離子形成多巴色素(MW=149),對應質譜圖中的m/z150[M+H]+;隨后,多巴色素與多巴胺通過分子間氫鍵形成加合物(MW=302),對應質譜圖中的m/z303[M+H]+。該結果與文獻[20]報道不同,在文獻中,多巴胺在10 mmol/L NH4Cl中的電化學氧化產物主要為多巴醌(MW=151),對應的質子化質譜信號為m/z152。以上結果表明,不同反應體系中的電化學反應過程不同。

圖5 磷酸緩沖鹽中多巴胺的電化學氧化機理Fig.5 Electrochemical oxidation mechanism of dopamine in PBS

3 結論

本研究搭建了一套由自制的體積小、性能穩定、結構簡單、制作方便的流動電解池和可實現高鹽溶液中痕量有機組分分析的大氣壓化學電離源組成的電化學-質譜聯用裝置,并建立了磷酸鹽緩沖溶液中多巴胺電化學氧化過程的在線分析方法。電化學質譜分析結果表明,在磷酸鹽緩沖溶液中,多巴胺首先在電極表面發生氧化,失去4e-形成多巴色素,然后進一步與多巴胺通過分子間氫鍵作用形成加合物。本研究結果與文獻報道的以NH4Cl為電解質氧化形成的多巴醌不同,說明了不同電解質中電化學反應過程不同,同時也表明了開展高濃度緩沖鹽溶液中電化學反應研究的重要性。該裝置和方法在研究高濃度緩沖鹽溶液中電化學反應方面將具有廣闊的應用前景。