原發性醛固酮增多癥的分子機制研究進展

蔣怡然， 王衛慶

（上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院內分泌代謝科 上海市內分泌代謝病研究所國家代謝性疾病臨床醫學研究中心（上海） 國家衛健委內分泌代謝病重點實驗室上海市內分泌腫瘤重點實驗室，上海 200025）

原發性醛固酮增多癥是繼發性高血壓最常見的形式，早期診斷和治療對預防不良心血管結局至關重要。近年來，隨著分子診斷進展，發現驅動醛固酮合成的基因胚系和體系突變是導致疾病發生的主要機制。本文將闡述原發性醛固酮增多癥的分子機制及基于機制的動物模型。

基因突變與原發性醛固酮增多癥

一、 內向整流型鉀離子通道亞家族J 成員5（recombinant potassium inwardly rectifying channel subfamily J, member 5，KCNJ5）基因

2011 年，Choi 等[1]在22 例醛固酮腺瘤（aldosterone-producing adenomas，APA） 患者中發現8 例KCNJ5體細胞突變。 人類KCNJ5基因編碼G 蛋白耦聯內向整流鉀離子通道4 蛋白（G proteincoupled inwardly-rectifying potassium channels 4,GIRK4），APA 組織中KCNJ5突變導致GIRK4 蛋白結構和功能改變，最常見的突變包括p. Gly151Arg、p. Thr158Ala、 p. Leu168Arg，位于通道選擇性過濾器區域，突變使鉀離子選擇性缺失，增加鈉離子滲透性，因電壓-門控鈣離子通道開放導致膜去極化，激活鈣離子信號通路， 并最終增加醛固酮合成酶（aldosterone synthase,CYP11B2） 表達和醛固酮生物合成。

KCNJ5體細胞突變在APA 中最為常見， 西方國家報道APA 中KCNJ5突變率約40%[2-3]， 在亞洲國家更高，為60%～77%[4-5]。KCNJ5突變的腺瘤患者更年輕，女性多見，血醛固酮水平更高，腫瘤體積更大。 Cao 等[6]通過二代測序發現KCNJ5突變率為80.7%，同時發現10 個新的顯著突變基因（significantly mutated genes, SMG），并提出APA 基因表達譜， 為原發性醛固酮增多癥進一步分子分型奠定基礎。 相比其他突變，攜帶KCNJ5突變的APA 表達CYP11B1 細胞比例更高，但CYP11B2 及GIRK4 蛋白表達較低[7]。 也有研究表明KCNJ5突變是腎上腺切除術后手術獲益的標志[8]。KCNJ5胚系突變與家族性醛固酮增多癥Ⅲ型 （familial hyperaldosteronism Ⅲ,FH-Ⅲ）相關。 2008 年，FH-Ⅲ首次被描述， 臨床表現為嚴重早發性高血壓伴低鉀血癥[9]，之后在此患者中鑒定出KCNJ5基因種系突變[1]。在FH-Ⅲ家系中觀察到不同嚴重程度的醛固酮增多癥，部分患者嚴重程度與KCNJ5突變類型相關[10]。體外研究表明， 高劑量鈣通道阻滯劑維拉帕米或大環內酯類藥物可以阻斷突變的GIRK4， 從而降低CYP11B2 表達和醛固酮合成[11]。 目前已有針對該現象進行的臨床研究， 以評估大環內酯類藥物用于KCNJ5突變的APA 的無創診斷及靶向治療效果[12]。

二、L-型電壓依賴性鈣離子通道α1D 亞基（calcium channel, voltage-dependent, L type, alpha 1D subunit，CACNA1D） 和T-型電壓依賴鈣離子通道α1H 亞基（calcium channel, voltage dependent,T-type, alpha 1H subunit，CACNA1H）基因

CACNA1D基因編碼L 型鈣通道Cav1.3 的α1亞單位，包含4 個重復結構域（Ⅰ～Ⅳ），每個重復結構域有6 個跨膜段（S1～S6）。 這些改變的殘基位于S6 片段中沿溝道孔排列，突變影響Cav1.3 通道多種特性， 包括延遲電壓門控依賴的失活狀態或者在低水平去極化情況下誘導通道開放， 細胞內鈣離子聚集，醛固酮大量合成，導致APA 發生[13-14]。利用CYP11B2 免疫組化引導的高通量測序發現該突變在美國、 法國及非裔APA 患者中分別為21%、37%和42%[15-16]。而在2 例嚴重早發醛固酮增多癥患兒中發現CACNA1D的新種系突變，該醛固酮增多癥與復雜的神經障礙[原發性醛固酮增多癥、癲癇發作和神經異常（syndrome of primary aldosteronism, seizures and neurologic abnormalities，PASNA）]相關[17]。

CACNA1H基因轉錄翻譯T 型鈣離子通道Cav3.2， 該基因的胚系突變影響Cav3.2 通道特性，誘導其功能增強，導致鈣離子內流增加，激活鈣信號通路，是FH-Ⅳ的發病基因。一項研究發現5 例患兒具有CACNA1H的p.Met1549Val 位點突變，在10 歲前就出現APA[18]，其中2 例患兒伴有發育遲緩或注意力缺陷障礙。 在家族遺傳的成人患者中也同樣發現了CACNA1H的胚系突變[19]。在一項75 例APA 患者研究中發現3 例CACNA1H的體細胞突變[20]， 提示該基因突變在散發APA體細胞中可能致病，但是更大規模的人群數據還有待進一步探究。 鈣通道阻滯劑可靶向用于CACNA1H突變或體細胞CACNA1D突變的APA患者。 也有報道PASNA 患者對于硝苯地平治療反應良好。

三、Na+-K+ATP 酶α1 亞單位（sodium/potassium ATPase alpha-1, ATP1A1） 和鈣離子轉運ATP 酶B3（ATPase plasma membrane Ca2+ transporting 3，ATP2B3）基因

Beuschlein 等[21]報道5.2%APA 患者攜帶ATP1A1突變，ATP1A1基因編碼細胞膜上ATP1A1，由10 個跨膜蛋白組成M1～M10 結構域和細胞內的N 端和C 端。ATP1A1的體細胞突變主要位于M1、M4 及M9 結構域。 M1 和M4 結構域中的突變會影響鉀離子結合帶，降低離子泵對鉀離子的親和性；M9 結構域中的突變可能會影響鈉特異性位點，所有突變都降低離子泵的活性。 對鉀離子親和性降低和離子泵活性的下降在不明顯升高細胞內鈣離子濃度的情況下導致膜去極化。 利用CYP11B2 免疫組織化學（組化）引導的高通量測序技術發現8%～17%的APA 患者具有ATP1A1突變。

Beuschlein 等[21]報道1.6% APA 患者攜帶ATP2B3突變，ATP2B3基因編碼細胞膜鈣泵（Ca2+-ATP 酶，又稱PMCA3），由10 個跨膜蛋白組成M1～M10 結構域和細胞內的N 端和C 端。 所有ATP2B3突變均是框內缺失突變， 影響在M4 結構域的PEGL（脯氨酸-谷氨酸-甘氨酸-亮氨酸）位點，該區域參與鈣結合以及離子門控。 一些研究發現1.7%～10% APA 中攜帶有ATP2B3突變， 利用CYP11B2免疫組化引導的高通量測序技術這一比例可進一步提高。ATP2B3突變導致離子泵活性下降，使鈣外流受損，增加胞漿內的鈣離子濃度，激活鈣信號通路。 另外有研究證明，該突變可能通過離子泵的鈉離子內流，導致細胞膜去極化，從而使電壓門控的鈣離子通道開放，或由鈣內流直接引起細胞內鈣離子濃度增加[22]。

四、氯化物通道2（chloride channel 2, CLCN2）基因

FH-Ⅱ是FH 最常見形式， 其表型具有多樣性，既往FH-Ⅱ診斷基于2 個或2 個以上家庭成員受到影響，且無法確定其他的遺傳病因[23]。 2018年發表的一項研究中， 在第一個報道FH-Ⅱ家族中發現了編碼氯離子通道ClC-2 的CLCN2種系突變[24]。CLCN2編碼在腎上腺、腎小球表達的電壓門控的氯離子通道，該通道在超極化膜電位下開放，通道開放使腎小球細胞去極化，并誘導醛固酮合成酶的表達。 基因突變可使通道功能增強，在腎小球靜息電位下的開放率更高，該研究證明了陰離子通道在腎小球膜電位測定、醛固酮生成和高血壓中的作用[25]。 而在多項對APA 行全外顯子組測序的研究中， 均未發現體細胞的CLCN2突變。

五、β-連環素（catenin beta-1, CTNNB1）、環磷酸腺苷激活性蛋白激酶α 催化亞基（protein kinase cAMP-activated catalytic subunit alpha, PRKACA）和犰狳重復序列蛋白質5 （armadillo-repeat containing 5, ARMC5）基因

CTNNB1基因編碼β-連環素，在2.1%～5.1%APA 中可檢測到該基因的體細胞突變[26]。CTNNB1突變定位于3 號外顯子，在皮質醇分泌腺瘤及腎上腺皮質癌中也曾被發現。 有研究發現女性中該突變更為普遍， 且提示與懷孕期間性腺受體在APA內的異常表達相關[27]，但沒有CTNNB1基因突變的APA 組織內同樣發現由性腺激素調控醛固酮合成的現象。PRKACA基因催化合成環磷酸腺苷依賴蛋白激酶催化亞基α （cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit α）， 在2 例APA 及1 例醛固酮和皮質醇共分泌的患者中發現有該基因的體細胞突變[28]。 皮質醇腺瘤中也存在PRKACA突變，其在自主醛固酮生成和APA 發展中的作用尚不清楚。在美國非裔原發性醛固酮增多癥患者中觀察到ARMC5的胚系突變[29]，以及在歐洲的一個原發性醛固酮增多癥患者隊列中發現有胚系ARMC5突變，但是后者經生物學工具預測，未提示有明確的致病作用[30]。 之前的研究提示ARMC5突變與原發性大結節性腎上腺增生的皮質醇增多癥相關。以上3 個基因的體細胞突變在APA 中均較罕見，其與其他腎上腺疾病關系更多。

醛固酮產生細胞簇的研究進展

醛固酮產生細胞簇 （aldosterone-producing cell clusters, APCC） 的概念首先于2010 年被提出和描述[31]。 在此之前，醛固酮合成酶（CYP11B2）的表達及醛固酮的合成被認為只發生在腎上腺球狀帶細胞內，并主要受血管緊張素Ⅱ及鉀離子調控。APCC位于包膜下，主要由外部的球狀帶樣細胞和內部的束狀帶樣細胞組成。 利用CYP11B2 免疫組化指引的二代測序技術分析APCC 的基因突變， 結果在35%的APCC 內發現與APA 相同的腫瘤驅動基因，包括CACNA1D、ATP1A1、ATP2B3， 但是沒有發現KCNJ5突變[32]。 近來，有研究描述了從APCC 到APA的轉變過渡狀態，包括包膜下APCC 樣結構和微小APA 樣結構組成， 并且帶有體細胞突變， 提示APCC 可能是APA 發生的起點[33]。 然而，有其他研究表示APA 的發展有兩條獨立的路線， 結果顯示毗鄰APA 的腎上腺皮質可能出現球狀帶的增生及結節增多，血管生成減少。 相互遠離的CYP11B2 陽性結節在同一腎上腺內可能帶有不同的體細胞突變， 與APA 相鄰的不同APCC 同樣可能帶有不同的體細胞突變[34]。 在過去10 年中，對于APCC 的發現和探索為理解調控醛固酮生物合成的機制提供了一種新的模式，但其在正常腎上腺中的生理性作用有待進一步研究。APCC 中存在APA 驅動基因的體細胞突變， 表明其可能在APA 及增生型醛固酮增多癥的發生、發展過程中發揮作用，APCC 模型支持APA 可能來源于APCC 的觀點。

原發性醛固酮增多癥的動物模型

以上遺傳學研究極有助于理解原發性醛固酮增多癥的發病機制，明確了離子通道以及Wnt/β-連環素信號通路的重要作用。雖然小鼠模型并未能完全復制人原發性醛固酮增多癥的典型癥狀，但其在機制的深入研究、藥物的篩選研發中有著不可替代的作用。研究同樣發現鉀通道與Wnt/β-連環素信號通路在調節腎上腺皮質醛固酮合成和穩態中起關鍵作用。 在小鼠中， TASK1 和TASK3 是鉀通道的雙孔域蛋白，由KCNK3和KCNK9基因編碼合成。通過全身敲除這2 個基因， 研究明確了鉀通道在腎上腺皮質結構和功能中的重要作用， 敲除基因小鼠出現不同形式的醛固酮增多癥/低腎素性高血壓[35-37]。

如前述CACNA1H激活突變在人群中導致FH-Ⅳ， 最新有研究利用規律成簇間隔短回文重復序列 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）/CRISPR 相關蛋白9（Cas9）在小鼠中敲入M1560V 突變位點， 并同時研究CACNA1H基因敲除小鼠。結果顯示，突變小鼠醛固酮明顯升高，CYP11B2表達也明顯增加。 敲除小鼠的Ren1表達升高， 但是CYP11B2表達沒有改變。以上小鼠實驗結果是人群基因測序結果的有力補充，證明了CACNA1H胚系突變足以引起原發性醛固酮增多癥， 并且在Cav3.2 丟失后能通過激活腎素-血管緊張素系統進行功能代償[38]。

前述CLCN2突變是FH-Ⅱ的致病基因，2 種不同的基因敲入小鼠模型提供了有關氯離子通道在原發性醛固酮增多癥發展中的作用[39-40]。 敲除在ClC-2 氯離子通道失活區域的N 端8 個殘端，而人p.Met22Lys、p.Gly24Asp 和p.Tyr26Asn 突變均在該區域，可以使小鼠同樣出現高血壓、低血鉀癥、醛固酮升高和腎素水平降低，重現原發性醛固酮增多癥的主要特征。攜帶p.Arg180Gln 雜合突變的小鼠，與FH-Ⅱ中發現的人p.Arg172Gln 突變相似， 表現為輕度原發性醛固酮增多癥， 包括醛固酮水平升高，輕度血壓升高，但沒有導致腎上腺形態的異常。這些模型是研究FH-Ⅱ自主醛固酮產生機制有價值的工具。 此外，有研究利用人工突變模擬大部分原發性醛固酮增多癥相關的人CLCN2突變， 結果有力地支持了以下觀點，ClC-2 離子內流增加足以導致原發性醛固酮增多癥，而不需其他額外突變相關的機制參與。