DNA甲基化修飾在Graves病發病機制中的研究進展

初衛江

(萊州市人民醫院 內分泌科,山東 萊州 261400)

Gravers病(Graves' disease,GD)又稱毒性彌漫性甲狀腺腫,是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病。其特點是患者免疫耐受力喪失,自身免疫細胞對甲狀腺組織產生攻擊,刺激機體產生促甲狀腺激素受體(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)抗體,通過激活TSHR,機體產生過量的甲狀腺激素[1]。GD多見于女性,患病的高峰年齡在30～60歲,60歲之后患病率顯著下降[2]。在我國,GD 的發病率為15～30/10萬[3]。GD 的發病機制復雜,易感因素包括環境因素、內源性因素和遺傳因素等,越來越多的證據表明表觀遺傳因素在GD發生發展中起到重要作用[4]。DNA甲基化是常見的表觀遺傳機制,在胞嘧啶堿基上共價加成一個甲基,隨后轉化為5-甲基胞嘧啶,這一過程主要由DNA 甲基轉移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)催化完成。甲基在DNA 上的添加和去除是由特定的染色質修飾蛋白調控的,這是一個可逆的過程,并受到動態調節[5]。本文主要針對DNA 甲基化在GD 中的研究現狀進行綜述。

1 DNA甲基化與基因表達調控

異常的DNA 甲基化可導致細胞增殖失調、發育缺陷、自我更新能力受損和免疫調節異常等多種生物過程[6-7]?；蛐秃捅硇椭g在某些情況下會存在差距,表型的出現并不局限于細胞內提供的遺傳信息,還受到外部環境信息變化的影響,隨著時間推移,在多細胞水平上表現出來[8]。因此,當分析原始DNA序列以獲取表達信息時,必須考慮存在于原始DNA序列之外的輔助力量。DNA 甲基化被廣泛認為是基因沉默的穩定調節劑,通過改變DNA 分子構型和染色體結構特性,調節遺傳信息的表達[9]。DNMTs催化DNA 在特定的位置上進行甲基化修飾,調控轉錄區域的CpG 島發生DNA 甲基化,某些特異性甲基化結合蛋白會與CpG 島相結合,通過順式作用元件序列保留CpG 島,繼而影響組蛋白修飾,影響相關基因的轉錄和表達,導致疾病的發生[10]。

2 DNA甲基化與GD的發病機制

2.1 DNA甲基化在GD 發生發展中的作用

多種因素與GD 的DNA 甲基化改變有關,包括吸煙、碘、丙型肝炎感染、壓力和內分泌失調等[11]。這些因素使DNA 甲基化水平發生變化,打破了自我耐受調節和基因表達穩態。此外,DNA 甲基化在維持T 細胞功能中起著至關重要的作用[12]。當維持成熟T 細胞的DNA 甲基化水平和模式發生變化時,可導致T 細胞發生自身免疫。這可能是由于藥物作用或者有絲分裂期間編碼DNMTs的基因沒有被激活,從而導致GD 等自身免疫性疾病的發生。研究發現[13-14],GD 患者中有82 個高甲基化基因和103 個低甲基化基因,功能富集分析表明,高甲基化基因主要參與調控細胞生長代謝,而低甲基化基因則參與調控細胞生長、凋亡及免疫功能。

2.2 GD相關免疫因子的異常DNA甲基化

研究發現[13],與GD 相關的免疫因子存在異常DNA 甲基化,包括免疫調節因子β2 腎上腺素受體(beta2-adrenergic receptor 2,ADRB2)的高甲基化和參與淋巴細胞活性調節的β-1,3-N-乙酰葡糖胺基轉移酶(beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2,B3GNT2)基因高甲基化。ADRB2 基因是一種重要的免疫調節因子,除輔助性T(T-helper 2,Th2)細胞外,所有淋巴樣細胞均表達ADRB2。去甲腎上腺素和腎上腺素可通過刺激ADRB2-cAMP-蛋白激酶A通路,選擇性抑制Th1應答和細胞免疫,使Th2向體液免疫的主導地位轉變[15]。在GD 組織樣本中存在Th1和Th2的混合模式,高甲基化的ADRB2基因會擾亂Th1/Th2細胞因子平衡,最終使GD 中Th1細胞的數量和Th1/Th2細胞的比例升高,在免疫反應期間吸引免疫效應物到達炎癥部位,促進炎癥擴展,這成為GD 發病的重要因素[16]。

B3GNT2是聚氨基乳糖的主要合成酶,在免疫系統中高表達,這對維持免疫耐受,調節免疫細胞功能及免疫細胞的激活、成熟和凋亡具有重要作用[17]。敲除小鼠B3GNT2基因后,免疫細胞中糖蛋白上的聚氨基乳糖顯著減少,導致免疫細胞對刺激具有超敏和高反應性,表明聚氨基乳糖對過度免疫反應的抑制作用[18]。B3GNT2 與免疫相關的全基因組研究表明,降低B3GNT2表達的單核苷酸多態性與類風濕性關節炎、強直性脊柱炎以及GD 等自身免疫性疾病有關[19-20]。

2.3 GD與DNMT基因多態性

研究表明[21-22],DNMT 是自身免疫性疾病的遺傳危險因素,DNMT1中GG 基因型與DNA 低甲基化和GD 的難治性相關。Cai等[23]報道GD 患者DNMT3B基因中的SNP rs2424913和DNMT1基因中的SNP rs2228611 與GD 易感性相關。SNP rs2424913是DNMT3B 啟動子區的一種多態性,從等位基因C到等位基因T 的過渡使體外啟動子活性增加30%[24]。等位基因C 的升高表明GD 患者DNMT3B 啟動子活性降低。因此,來自DNMT3B的SNP rs2424913可能與GD 風險相關。

2.4 Graves眼病與DNA甲基化

Graves眼病是GD 患者最常見的甲狀腺外表現,眼眶成纖維細胞某些基因會發生高甲基化或低甲基化,涉及CpG 啟動子,從而干擾轉錄因子募集[25]。異常的DNA 甲基化修飾可促進炎癥反應,并調節參與眼眶成纖維細胞和脂肪形成的多種信號分子表達,從而導致眼眶組織纖維化和炎癥浸潤[4]。狹縫同源物(slit homolog-2,SLIT2)作為一種軸突導向糖蛋白,由眼眶成纖維細胞表達,甲狀腺激素可提高其表達水平。SLIT2在Graves眼病中具有較低的甲基化水平,蛋白聚糖作為自身抗原通過激活CD4+T 細胞參與炎癥過程,抑制纖維細胞的分化,并顯著增加纖維細胞產生的炎性因子[26]。這種調節眼眶成纖維細胞炎癥的作用使SLIT2 在調節Graves眼病的進展中發揮作用。

3 GD與相關分子的DNA甲基化

腫瘤壞死因子-α、干擾素、白細胞介素和細胞間黏附分子等DNA 甲基化與GD 的發生發展密切相關,下面逐一探討這些分子的DNA 甲基化修飾在GD 中的作用。

3.1 腫瘤壞死因子-α的DNA甲基化

腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一種由Th1淋巴細胞、單核細胞和甲狀腺細胞分泌的炎性細胞因子,在啟動和發展自身免疫疾病中起著重要作用[27]。研究發現[28],GD 活動期和復發期患者TNF-α水平顯著升高,其多個CpG 位點甲基化水平顯著降低。GD 炎癥過程啟動和加速的共同機制是Th1細胞因子/趨化因子軸[29]。Th1細胞產生TNF-α,刺激GD 患者甲狀腺細胞和Graves眼病的眶后細胞分泌趨化因子C-X-C 配體10(chemokine C-X-C ligand 10,CXCL10)、CXCL9和CXCL11,后者結合并激活Th1細胞上的趨化因子3受體,促進TNF-α釋放,從而形成正反饋回路,加速受累器官炎癥細胞的募集和激活[30]。此外,在GD 中,CXCL10介導的Th1細胞募集主要在疾病的早期階段發揮作用,活動性和復發性GD 患者血清CXCL10 水平較高,治療后降低,表明GD 活躍期的啟動和復發是由Th1淋巴細胞決定的[29]。

3.2 干擾素的DNA甲基化

干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)由Th1 細胞分泌,可激活細胞毒性T 細胞,并減少Th17分化,從而抑制體液免疫。研究發現[31],難治性GD 患者IFN-γ啟動子區-54 CpG DNA 甲基化水平明顯高于緩解期GD。這表明IFN-γ啟動子DNA 甲基化與GD 嚴重程度和治療反應之間存在關聯,高水平的DNA 甲基化可能會抑制IFN-γ的表達,增強Th17的分化,導致難治性GD,INF-γ-54 CpG 的甲基化是GD 難治性的一個重要表觀遺傳因素。然而,沒有證據表明該甲基化水平與甲巰咪唑劑量之間存在相關性。

此外,IFN-α功能異常也與多種自身免疫性疾病有關,GD 是IFN-α治療病毒性丙型肝炎的常見副作用[32]。Lafontaine等[11]報道了3 例丙肝患者,接受IFN-α治療8個月后確診合并GD,這提示IFN-α與GD 發病有很強的相關性。CXCL10、CXCL9 以及CXCL11等IFN-α相關的基因被報道與自身免疫性疾病有關[33]。研究發現[34],Graves 眼病患者的CD4+T 細胞中IFN-α 相關基因四肽重復序列1(tetratricopeptide repeats 1,IFIT1)、干擾素調節因子7(interferon regulatory factor 7,IRF7)、粘病毒抗性1(myxovirus resistance 1,MX1)、寡腺苷酸合成酶1(oligoadenylate synthetase 1,OAS1)、泛素特異性蛋白酶18(ubiquitin-specific protease 18,USP18)及含自由基s-腺苷甲硫氨酸結構域蛋白2(radical s-adenosyl methionine domain-containing protein 2,RSAD2)呈低甲基化水平,表明這些基因的DNA 甲基化異?？赡軈⑴cGD 發病。

3.3 白細胞介素的DNA甲基化

白細胞介素(interleukin,IL)是調節機體免疫系統功能主要因子之一,可調節免疫細胞的活性及免疫應答。IL-6參與B 細胞分化和T 細胞增殖,并與轉化生長因子β 結合,誘導Th17 細胞發揮促炎作用[35]。研究發現[36],難治性GD 患者IL-6 水平升高,IL-6啟動子區-664 CpG 位點和666 CPG 位點的DNA 甲基化水平低于健康對照組和緩解期GD 患者,而外周血中Th17細胞的比例高于緩解期GD 患者。因此推測IL-6基因甲基化水平降低可促進IL-6產生及Th17分化。研究發現[31],Th17細胞的增加參與了頑固性GD 的進展,這意味著GD 治療難度的進一步增大。

此外,白細胞介素-2 受體(interleukin-2 receptor,IL-2R)的α亞單位參與T 細胞功能的調節。T細胞表面有許多IL-2R 分子表達,IL-2R 啟動子區域的表觀遺傳修飾會影響該基因的表達。研究發現[37],GD 患者IL-2R 基因啟動子的DNA 甲基化顯著降低,低甲基化可以改變CD4+和CD25+調節性T細胞上IL-2R 基因的表達,競爭性結合IL-2,通過調節性T 細胞功能,影響GD 的發生。

3.4 細胞間黏附分子-1的DNA甲基化

細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)是一種由內皮細胞、白細胞和甲狀腺濾泡細胞表達的糖蛋白[11]。ICAM-1是人類卵巢癌細胞中的表觀遺傳沉默基因,通過啟動5-mC 氧化參與DNA 去甲基化[38]。GD 患者中,ICAM-1 在甲狀腺細胞和外周血中均表達增加,ICAM-1被認為是影響GD 易感性的重要危險因素[39]。研究發現[40],GD 患者ICAM-1基因DNA 甲基化水平顯著降低,ICAM-1基因低甲基化會導致參與GD 炎癥過程中的多種免疫激活相關的基因過表達,從而導致對甲狀腺細胞的自身免疫攻擊。ICAM-1 低甲基化還與Graves患者突眼程度及促甲狀腺免疫球蛋白水平呈正相關[40]。促甲狀腺免疫球蛋白會特異性增加細胞表面ICAM-1基因的表達,募集淋巴細胞到甲狀腺,促進自身免疫攻擊。由此表明,ICAM-1 基因DNA甲基化改變在GD 的發展中起著重要作用。研究發現[41],抗ICAM-1單克隆抗體治療,可顯著降低血清甲狀腺素及促甲狀腺激素抗體水平,減緩GD 小鼠的體重減輕程度,這表明ICAM-1 有望成為臨床治療GD 的靶點之一。

4 總結與展望

綜上所述,DNA 甲基化修飾作為一種常見的表觀遺傳機制,對GD 的發生發展產生影響。然而,目前表觀遺傳學研究還處在起步階段,還有很多與GD發病或患者預后相關的DNA 甲基化異?；驎翰幻鞔_。單一基因DNA 甲基化檢測是否能作為GD 的診斷標準,未來還需進一步探索。以DNA 甲基化為切入點研發治療GD 的新藥物,有望成為未來的研究新領域,對該病的治療具有深遠意義。