基于網絡藥理學探索鬼箭羽治療糖尿病的機制 *

汪 洋 葉河楊 申小年

（1.安徽中醫藥高等?？茖W校臨床醫學系，安徽 蕪湖 241002；2.安徽中醫藥高等?？茖W校中醫學系，安徽 蕪湖 241002）

糖尿病的特征為，臨床表現為多尿、多飲、多食、煩渴、消瘦和疲勞等癥狀，嚴重時可導致酮癥酸中毒以及種種并發癥和伴隨癥。Ⅰ型糖尿?。═1DM）是一種代謝功能障礙，特征是胰島β 細胞的選擇性破壞，氧化應激在這種疾病狀態的表現中起重要作用［1］。胰島素分泌和活性的相對不足或絕對缺乏，導致高血糖和脂肪及蛋白代謝改變。Ⅱ型糖尿?。═2DM）是一種發病率和病死率都很高的慢性低度炎癥性疾?。?］。鬼箭羽具有調節血脂、降低血糖的作用。

網絡藥理學方法可應用于化合物的篩選［3］。本研究旨在通過網絡藥理學和分子對接的方法，預測鬼箭羽治療糖尿病的潛在靶點和作用機制。

1 材料與方法

1.1 中藥活性成分及其潛在目標靶點和疾病靶點的收集以漢語拼音“guijianyu”為關鍵詞，數據來自中醫系統藥理學數據庫（TCMSP，https：//tcmspw.com/index.php），從該庫中篩選鬼箭羽在吸收、分布、代謝、排泄過程中的活性分子，即口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18。本研究采用OB≥0 和DL≥0，使用TCMSP 篩選潛在的生物活性成分?；赥CMSP 和Drug-Bank 數據庫，利用Perl 軟件和UniProtKB 檢索活性成分的靶點（http：//www.uniprot.org/），并進行基因注釋。

以“糖尿病”為關鍵詞，對基因卡（https：//www.genecards.org/）、藥物庫（https：//go.drugbank.com/）、靶點數據庫（TTD）、在線人類孟德爾遺傳（OMIM）和藥理學網站進行搜索，并篩選相關靶點。

1.2 獲取藥物靶點基因和疾病基因交集圖使用Venny 2.1 軟件，將篩選出的鬼箭羽的活性成分對應的靶點與DM 靶點對應的疾病靶點進行交叉，并通過維恩圖獲得共同靶點。將預測目標導入字符串數據庫（https：//string-db.org/），進行進一步預測。

1.3 繪制藥物靶點基因圖基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，確定共同目標和富集通路。使用GeneMANIA 數據庫分析基因-基因相互作用網絡，使用Cytoscape 構建藥物-靶點-通路網絡。使用Cytoscape 3.7.2 軟件生成活性組件與目標之間相互作用以及靶標之間相互作用的網絡圖，用網絡將藥物名稱、藥物活性成分、藥物與疾病交叉基因靶點及其之間的關系網絡導入Cytoscape 軟件，構建“藥物化合物靶點”網絡圖，進行可視化分析。

1.4 網絡建設與中央網絡拓撲分析利用Cytoscape 3.6.1 分析蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡的拓撲特性。用“節點”表示目標蛋白分子，用“邊”表示相互關系，根據中間中心性、接近中心性和程度，計算PPI 網絡的中間中心，使各成分與目標的相互作用顯示。

1.5 GO和KEGG途徑富集分析軟件和生物體（http：//www.bioconductor.org）進行核心靶基因ID，以進行GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析。選擇P＜0.05 進行功能注釋聚類。

2 結果

2.1 中藥活性成分及其潛在目標靶點機制利用TCMSP數據庫，在鬼箭羽中共分離并鑒定出8 個活性組分（見表1）。即篩選鬼箭羽（吸收、分布、代謝、排泄）的類藥性，OB≥30%、DL≥0.18。

表1 鬼箭羽的部分類藥性成分的分子信息

2.2 獲取藥物靶點基因和疾病基因交集圖根據網絡藥理學，通過數據庫篩選、收集到24 個活性化合物和181個“guijianyu”對應靶點、4621 個DM 靶點。通過交集，發現從數據庫中共鑒定出21 個化合物相關靶點與DM 有關（OB≥0，DL≥0）。獲得4621 個DM 靶基因和鬼箭羽21個活性成分的靶點共交集154疾病相關基因。見圖1。

圖1 鬼箭羽與糖尿病的交集目標的基因維恩圖

2.3 活性成分基因靶點網絡的構建為了明確中藥、活性成分和鬼箭羽的潛在靶點之間的關系，用網絡將藥物名稱、藥物活性成分、藥物與疾病交叉基因靶點及其之間的關系網絡導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建“藥物化合物靶點”網絡圖，進行可視化分析。見圖2。菱形組成的方塊為糖尿病基因，圓形為鬼箭羽藥物分子，其中三角形為基因與分子相交超過5 條邊的基因分子。網絡由175個節點、662條邊組成。

圖2 鬼箭羽藥物分子與糖尿病基因的交接圖

2.4 PPI網絡和核心基因網絡通過GO和KEGG通路富集分析，闡明鬼箭羽相關靶點的特征。核心靶蛋白GO項目數為17項（P＜0.05），其中生物過程（BP）154項、細胞組分（CC）43 項、分子功能（MF）17 項。關鍵靶點包括乙酰膽堿酯酶（AChE）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）和糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）。

字符串數據庫生成的PPI 圖中，有17 個目標具有很強的交互作用（置信度評分≥5），3 層菱形靶點組成的圓，其中中間層菱形靶點組成的圓為第一次篩選靶點，最內層的菱形靶點組成的圓為第二次篩選靶點（見圖3）?；诔潭群椭行亩?，我們發現腫瘤蛋白p53 基因（TP53）是治療DM的關鍵。

圖3 蛋白質間的相互作用網絡；潛在治療靶點的核心基因

2.5 GO和KEGG富集為了通過調節特定途徑來研究藥物治療中靶點的生物學效應，根據富集程度篩選前20項，并繪制柱狀圖。同樣選擇P＜0.05 作為聚類分析的重要路徑，根據富集程度篩選前20 項，繪制氣泡圖。GO 分析顯示（見圖4），大部分潛在的靶點在CC 中，包括藥物反應、活性氧代謝過程、對脂多糖的反應對細菌起源分子的反應。KEGG 富集分析顯示（見圖5～圖7），鬼箭羽影響了182 條通路（P＜0.05），主要富集通路包括脂質和動脈粥樣硬化、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、高級糖基化終末產物-受體（AGE-RAGE）信號通路在糖尿病并發癥中的作用、胰島素信號通路、腺分泌、胰高糖素信號通路等。

圖4 20個靶基因的GO富集分析

圖5 AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中的作用

圖6 脂質和動脈粥樣硬化信號通路在糖尿病并發癥中的作用

圖7 流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路在糖尿病并發癥中的作用

3 討論

中國是世界上糖尿病患者數量最多的國家，發病率為11.2%［4］。糖尿病本身不僅對人類健康有嚴重的危害，而且其并發癥也會給家庭和社會帶來沉重的負擔。目前，胰島素抵抗日益受到關注，急需解決，因為它不僅使患者有患Ⅱ型糖尿病的風險，而且還會導致代謝綜合征和心血管疾病等［5］。隨著科學技術的發展，鬼箭羽對糖尿病的治療效果得到了驗證。鬼箭羽的主要成分槲皮素、山柰酚、鬼箭羽堿等通過藥物相似性篩選，有可能成為治療糖尿病非常有前景的口服藥物。本研究旨在利用網絡藥理學策略評估鬼箭羽的潛在成分和作用靶點，揭示其抗糖尿病機制，并為下一步通過生物學實驗驗證其作用做準備。GO 和KEGG 分析表明，炎癥相關通路可能是參芪降糖顆粒調節胰島素抵抗的核心因素［5］。

結果表明，網絡藥理學提供了一種新的“多成分、多靶點、多效應”網絡模型。通過網絡藥理學來尋找參與鬼箭羽提供的緩解DM 的潛在分子靶點。在網絡藥理學獲得的核心分子靶點中，前6 個程度較高的靶點為絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT1）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤蛋白p53 基因（TP53）、腫瘤壞死因子（TNF）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）和血管內皮生長因子A（VEGFA），均被報道對炎癥緩解和血管生成有調節作用［6］。鬼箭羽中的生物堿、山柰酚和槲皮素等可通過調節葡萄糖、氨基酸和脂類代謝，發揮降血糖作用。山柰酚是鬼箭羽的有效成分，可通過調節hedgehog 信號通路降低IL-6和白細胞介素-1β（IL-1β）水平，從而發揮治療慢性萎縮性胃炎的作用［7］。此外，夏枯草的抗高血壓作用機制主要是通過甾醇和黃酮類化合物，影響TNF 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、MAPK 通路、PI3K-Akt通路相關靶標，如IL-6 和胰島素，發揮積極的抗高血壓作用［8］。鬼箭羽的主要成分即槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇，因此其血液動力學影響作用可能也在于它的甾醇類化合物作用。因此本文可為進一步揭示鬼箭羽的藥理作用機制提供方法學依據和理論依據。通過網絡藥理學探索其可能的機制，體現了多成分、多靶點、多途徑的特點，為今后鬼箭羽的實驗研究和臨床應用提供了理論依據。

4 結語

本研究通過網絡藥理學方法、分子對接技術，確定了鬼箭羽在DM 治療中的多成分、多靶點機制，為開發鬼箭羽活性化合物作為一種創新的DM 替代治療提供了理論依據。然而，我們也必須認識到，目前的網絡藥理學數據庫還不能包含所有參與DM 發展的信號分子，因此在我們的研究中可能還有一些重要的分子沒有發現，需要進一步的深入研究。本研究為今后鬼箭羽在DM 患者中的臨床應用提供了實驗依據。