IgA腎病的遺傳學研究進展

曾 賞,周緒杰

(北京大學第一醫院腎內科,北京大學腎臟疾病研究所,衛生部腎臟疾病重點實驗室,教育部慢性腎臟病防治重點實驗室,北京 100034)

IgA腎病(IgA nephropathy,IgAN)是全球最常見的原發性腎小球腎炎,在中國占原發性腎小球疾病的比例高達40%～50%[1],也是慢性腎臟病和終末期腎衰竭的重要原因,20%～40%的IgAN患者在20年內進展為終末期腎病[2]。它的診斷依賴于腎活檢,表現為腎小球系膜區含有IgA的免疫復合物沉積和組織病理學病變,如系膜細胞增生和細胞外基質積聚。近年來,IgAN的發病機制的主流觀點多為“四重打擊學說”,首先是在遺傳易感性的基礎上,個體在細菌或病毒感染后激發黏膜免疫反應,身體免疫應答出現失調后產生半乳糖缺陷型IgA1(Gd-IgA1),其觸發異?？咕厶强贵w應答產生抗Gd-IgA1的抗糖抗體,隨后形成免疫復合物并沉積在腎小球系膜中,激活補體系統和其他介質,刺激系膜細胞增殖、分泌系膜基質、細胞因子等而致腎小球炎癥反應,最終導致腎小球硬化和間質纖維化,見圖1。

IgAN的發病存在種族和地域的差異,非洲人群的發病率最低,歐洲人群的發病率中等,亞洲人群的發病率最高,有明顯的從西到東的上升趨勢[3]。其次,陸續有眾多家族性IgA腎病家系的報道[4]。在大多數已報道的家系中,IgAN遵循不完全外顯的常染色體顯性遺傳模式。越來越多的證據表明遺傳因素參與了IgAN的發病和進展。既往主要運用連鎖分析與候選基因關聯分析的方法來分析IgN的易感基因,而在過去的十年中,全基因組關聯研究(genome-wide association study,GWAS)進一步發現了與IgAN相關的遺傳變異。在多個GWAS中顯示出顯著關聯的位點主要參與抗原加工提呈、補體系統、粘膜先天免疫、粘膜IgA產生的調節、免疫應答和炎癥反應等,進一步支持“四重打擊學說”。這些GWAS發現的易感位點在某種程度上指明了IgAN的致病途徑,肯定了人體免疫、補體激活和Gd-IgA1的產生等在IgAN發病機制中的作用。然而GWAS定位到的遺傳變異多位于非編碼區,并不一定是真正的致病變異,所以需要對GWAS結果進行深入挖掘,以篩選功能位點并闡明其潛在的發病機制,從而指導未來的疾病診療、風險預測、藥物開發等在內的精準醫學。此外,隨著樣本量的增加以及基因分型和測序成本的降低,越來越多地使用全外顯子測序和全基因組測序來識別罕見變異,這可能解釋復雜性狀中遺傳力缺失的部分。文章總結了近年來IgAN遺傳學研究的現狀,并對該領域的關鍵挑戰進行了展望。

1 IgAN易感性的連鎖分析和關聯分析

連鎖分析是在家系中檢驗IgAN和等位基因間的遺傳模式,對中效或微效基因的定位效能不足。目前運用連鎖分析發現的IgAN易感區域包括2q36、3p23-24、4q26-31、6q22-23和17q12-22,但未在這些區域中尋找到致病基因[5～7]。

關聯分析是在人群中檢驗IgAN和等位基因間的相關性,包括有遺傳假設的候選基因關聯分析和無遺傳假設的GWAS。候選基因關聯分析是在已知病理生理基礎上,選擇一些可能與IgAN有關的基因分析其是否與疾病相關聯,其中既往研究主要包括了免疫識別相關基因[8～9]、腎素血管緊張素系統相關基因[10]以及細胞因子相關基因[11]等。然而因樣本量小,統計分析方法滯后和未在獨立人群中進行驗證等缺點。而GWAS是無先驗假說的在人類全基因組范圍內尋找與疾病關聯的遺傳變異。

2 IgAN易感性的GWAS研究

在過去的十多年中,GWAS逐漸揭示了IgA腎病的遺傳結構。見表1[12～22]。2010年發表的在歐洲人群進行的第一次GWAS在主要組織相容性區域(HLA-B、DRB1、DQA和DQB位點)檢測到一個強的全基因組顯著信號,該位點對抗原的加工和呈遞和適應性免疫至關重要[12]。由于受限于樣本量而沒有觀察到MHC區域以外的關聯。2011年第二個GWAS在東亞和歐洲人都證實了MHC中的關聯信號,還鑒定了兩個非MHC位點,包括補體因子H和HORMAD2區段[13]。CFHR1和CFHR3基因編碼因子H相關肽,調節補體旁路途徑的活性。研究顯示FHR1與H因子競爭結合表面固定的C3b,導致C3轉化酶的活性增加。CFHR1和CFHR3的保護性缺失與更高的循環中H因子水平和抑制補體旁路的局部激活有關[23]。起初定位的HORMAD2編碼粘膜免疫和炎癥的相關細胞因子。隨后發表的在中國隊列中進行的GWAS中還發現了另外兩個新的重要基因座,編碼與黏膜免疫相關的基因:TNFSF13和DEFA,它們分別編碼促進IgA產生的強大黏膜細胞因子APRIL(B細胞活化因子)和在粘膜表面分泌的對微生物病原體提供先天防御的α-防御素人抗菌肽[14]。隨后2014年發表的擴大樣本的多種族GWAS分析了歐洲和東亞血統的7658例病例和12954例對照,除了驗證MHC、HORMAD2、CFH、TNFSF13和DEFA位點的關聯外,該研究還發現了幾個新的基因座位,包括VAV3、ITGAM-ITGAX和CARD9,以及HLA和DEFA位點的新獨立信號[15]。VAV蛋白是B細胞適應性免疫功能和NF-κB激活所必需的鳥嘌呤核苷酸交換因子,這一過程刺激IgA的產生[24]。ITGAM和ITGAX編碼白細胞特異性整合素αM、αX,它們是參與白細胞粘附、遷移,介導巨噬細胞吞噬補體包裹的微粒的作用。CARD9是促進NF-κB通路激活的強促炎分子。2015年,Li等對先前報道的中國隊列進行擴展分析,并描述了三個另外的全基因組顯著位點,包括ST6GAL1、ACCS和ODF1-KLF10[16],這些基因座可能是亞洲特異性的。2017年,Kiryluk等對2633名歐洲和東亞血統的受試者進行了血清半乳糖缺陷IgA1 (Gd-IgA1)水平的定量GWAS,發現了兩個全基因組顯著位點,C1GALT1 (rs13226913,P= 3.2×10-11)和C1GALT1C1 (rs5910940,P= 2.7 × 10-8),它們編碼IgA1 O糖基化酶促反應所必需的分子伴侶[17]。2021年,我中心[18]在中國大樣本人群全面分析了參與中國人群糖基化異常IgA1形成的遺傳因素,測定了1127名IgA腎病患者的基因型及其血清中Gd-IgA1水平,共鑒定出2個與Gd-IgA1水平相關的基因座位:GALNT12和C1GALT1,其中GALNT12為新發現,兩個基因均參與編碼O-糖基化過程的糖基轉移酶;且二基因之間存在交互作用,并與IgA腎病的發病風險有關。

表1 目前GWAS報道的IgAN相關基因座位

近年來,多種族全基因組薈萃分析進一步發現了更多的IgAN的易感相關位點,為闡明IgAN的發病機制和解釋不同種族人群之間的易感性差異提供了重要的線索。2020年,Li等[19]通過對 10546 名患者和 21871 名健康對照者進行GWAS的薈萃分析,在1p36.13 (rs2240335)、1q23.1 (rs6427389) 和 6p25.3 (rs6942325) 上發現了三個新的遺傳風險位點包括PADI4、FCRL3和DUSP22/IRF4,并且在24個已確認的風險SNPs中顯示了7個位點的遺傳異質性。2023年,Kiryluk等[20]對 17 個國際隊列中的 10146 例 IgAN 病例和 28751 例對照進行了全基因組關聯研究和薈萃分析,發現了30個全基因組顯著風險位點,解釋了11%的疾病風險。其中共有16個新位點,包括TNFSF4/TNFSF18、REL、CD28、PF4V1、LY86、LYN、ANXA3、TNFSF8/TNFSF15、REEP3、ZMIZ1、OVOL1/RELA、ETS1、IGH、IRF8、TNFRSF13B和FCAR。這些研究中新位點的發現為IgAN發病機制的研究提供了新的思路。

3 IgAN易感性的后GWAS和二代測序研究

GWAS研究發現的僅僅是與疾病具有統計相關性的位點,跟生物學關聯還存在差距,因為GWAS 所分析的芯片設計基于標簽SNP。后續還需根據連鎖不平衡信息進行基因型填補或靶向重測序來獲得GWAS分析未包含的遺傳變異,再利用整合轉錄組、表觀遺傳等多組學和基因組結構數據及孟德爾隨機化的應用,對相關變異進行基因注釋篩選候選的功能位點做進一步的功能注釋,接著開展體內外實驗來闡明致病變異的分子機制,進而應用于疾病的預防篩查、風險評分和臨床治療等。

然而GWAS固有的局限性包括只能檢測到常見的(頻率>1%～5%)變異,通常表現出相對較小的效應,且大多位于非編碼區域,所以GWAS往往只能解釋相對較小比例的疾病遺傳度。全外顯子組和全基因組測序技術的應用使得我們揭示了更多的非同義編碼變體,特別是那些頻率較低且具有中等到較大效應的編碼變體。

以往大量的GWAS發現22號染色體22q12.2基因座和IgAN有關聯,但是這個基因座包含多個基因,包括MTMR3、HORMAD2、LIF和OSM,然而其因果變體和IgAN發病機制的關聯原因并不清楚。為了闡明該區域的具體致病變異和致病機制,Wang等[25]基于包含 2762 例 IgAN 患者和 5803 個對照者的 GWAS 數據集對該遺傳區域進行精細定位,鑒定了2個與IgAN發病關聯的位點:rs4823074和rs16988135,并將rs4823074確定為與永生化淋巴母細胞中 MTMR3 啟動子相互作用的候選因果變異。他們進一步用共定位和孟德爾隨機化分析發現與血清IgA水平相關的變異在該位點與IgAN風險等位基因共定位的先驗概率為88.7%,兩者也存在著很強的因果關系。這些結果說明MTMR3/HORMAD2/LIF/OSM 區域的遺傳變異能夠通過上調MTMR3的表達來升高血清IgA水平,進而影響IgAN發病。此外,體外機制研究表明,MTMR3 依賴于其磷脂酰肌醇 3-磷酸結合域來增加 IgA 的產生;體內功能研究表明 Mtmr3-/-小鼠表現出 Toll 樣受體 9(TLR9) 誘導的 IgA 產生和腎小球 IgA 沉積的缺陷?？傊?在MTMR3-HORMAD2區域鑒定了2個與IgAN發病關聯的位點,并進一步確定其靶基因為MTMR3,闡明了 MTMR3 通過增強 TLR9誘導的 IgA 免疫在 IgAN 發病機制中的作用,表明通過MTMR3抑制靶向黏膜IgA免疫可能代表了一種有前途的IgAN特異性治療新方法。

包括補體因子 H (CFH) 基因和補體因子 H 相關(CFHR)基因等多個補體調節基因的1q32是IgAN易感性基因座[13]。CFHR5、CFHR2和CFHR1具有二聚化基序,能夠形成同源和異二聚體,增強這些蛋白質對C3b的親和力,使它們能夠作為因子H的競爭性拮抗劑發揮作用[26]。為了探索CFHR5變異對IgAN易感性的遺傳影響,Zhai等[27]招募了500名IgAN患者和576名健康對照組,對CFHR5的所有外顯子及其內含子側翼區域以及非翻譯區域進行了測序,并使用序列核關聯檢驗比較了已識別變異的頻率。他們在CFHR5中發現了28個罕見變異,其分布與對照組差異顯著。對檢測到的28個罕見變異的分析確定了9個具有潛在功能,包括3個改變蛋白質長度的變體和三個通過體外可增加C3b與重組CFHR5結合的變體如CFHR5-M、CFHR5-S和CFHR5-D。這些CFHR5罕見的變異有助于IgAN的遺傳風險。2017年,Medjeral-Thomas等[28]發現較高的血清 CFHR-5 水平與IgAN免疫治療失敗、毛細血管內細胞增多以及疾病嚴重程度的組織學評分(牛津分類 MEST 評分)有關。Zhu等[29]發現高CFHR-5水平增加eGFR下降超過30%或終末期腎病的風險(HR=1.23)。

GWAS的研究形式更容易發現效應較弱的常見變異,而在某種程度上忽略了編碼區外顯子的罕見突變,后者往往對疾病的影響效應更大。外顯子區域在人類基因組中僅占1%,卻包含合成蛋白質所需要的重要信息,涵蓋了與個體表型相關的大部分功能性變異。隨著二代測序技術的發展,研究者們開始關注到罕見變異對復雜疾病性狀的影響,但由于測序成本高昂,難以在大規模人群中開展。Illumina公司設計的Human Exome BeadChip外顯子基因芯片,包含了一系列已知的少見編碼區變異,支持經濟高效的大規?；蚍中秃秃Y選研究。Zhou等[21]對3363名IgA腎病患者和9879名漢族血統的健康對照者進行了一項基于外顯子芯片的兩階段IgAN的關聯研究,發現三個非HLA基因區域的FBXL21、CCR6和STAT3和兩個HLA基因區域的GABBR1和CFB這5個新的易感基因參與了IgA腎病的發生。Li等[22]對8529例IgAN患者和23224例對照者進行了一項基于外顯子組芯片的IgA腎病相關性研究和測序分析,在編碼血管內皮生長因子a (VEGFA)的基因中發現了一種罕見的變異VEGFA V167I,這種變異與IgA腎病風險增加兩倍顯著相關。分子模擬實驗表明,該變異可能引起構象改變,使VEGFA蛋白更加穩定和緊湊以及增加與其受體VEGFR1和VEGFR2的結合親和力。然而這些發現的蛋白編碼變異需要進一步的功能實驗來確定其IgA腎病發病機制中的作用。

4 IgAN GWAS的臨床轉化

4.1 疾病風險預測IgAN是復雜的多基因疾病,如前所述,GWAS已為IgAN積累了豐富的疾病相關基因變異位點。全基因組多基因風險評分(genome-wide polygenic risk score,GPS)的計算是風險等位基因的加權總分,可用于識別疾病高危個體以進行臨床干預,并提供比傳統臨床風險評分更多的信息有望開展分層篩查。

Sukcharoen等[30]用從最大的歐洲GWAS中提取的 14 個SNP 生成IgA 腎病遺傳風險評分 (IgAN-GRS),并在來自英國腎小球腎炎DNA銀行(UKGDB)的464例經活檢證實的IgAN歐洲病例和379767名UKBB歐洲人中進行驗證,并使用IgAN-GRS的平均值來計算來自379767名UKBB歐洲人的14181名血尿和潛在IgAN的比例。結果顯示UKBB 人群中 15%～25%的不明血尿可能患有 IgAN,而該群體通?？赡懿粫邮苣I活檢或診斷。此研究表明多基因風險的非侵入性使用可能可以識別大量人群中腎臟表型的可能病因。近期Kiryluk等[20]設計并優化了 IgAN 的 GPS,并在獨立的德國慢性腎臟病 (GCKD) 研究中進行測試時,解釋了 7.3% 的疾病風險(P= 3.1 × 10-12;C-統計量=0.65;95%CI=0.61～0.68)。在2879名長期隨訪的IgAN患者中,高GPS患者有更高的腎衰風險[HR=1.17(95%CI:1.09～1.24),P=3.3×10-6]。位于GPS20%高分的個體發生尿毒癥的風險增加34%[HR=1.34 (95%CI:1.15～1.56),P=2.0×10-4],而在前10%的個體發生尿毒癥的風險增加48%[HR=1.48 (95%CI:1.22～1.79),P=6.6×10-5]。表明較高的多基因評分不僅增加疾病易感性,也增加進展至尿毒癥的風險。未來的研究需要關注多基因分層是否有助于診斷、臨床風險評估或治療反應預測。

4.2 藥物開發IgAN的GWAS研究的結果可概括為幾種關鍵的生物學途徑,為臨床新藥的研發提供了理論基礎。一項研究[20]對IgAN蛋白質互作分析中發現富集在趨化和細胞因子通路和細胞因子配體-受體交互作用,包括APRIL和它的受體TACI,IL-6相關細胞因子-受體對(IL6-IL6ST、LIF-LIFR/IL6ST和OSM-OSMR/LIFR/IL6ST)。值得關注的是,已知APRIL會改變IgA1的糖基化,IL6、LIF和OSM參與粘膜免疫,IL-6和LIF可促進致病性Gd-IgA1的產生。這些細胞因子有望開發未來的生物治療。同時對候選基因進行了藥物靶點的分析時,在前 26 個高度優先的“生物候選藥物”中,總共有13個基因座編碼的17個蛋白質已有藥物,11個基因座編碼的14個蛋白質預測可成藥。這些靶點中有11個(42%)是現有藥物。其中包括以下內容:①目前正在進行腎小球疾病臨床試驗的補體旁路途徑抑制劑如APL-2;②通過抑制 APRIL 或 TACI 來阻斷B細胞激活的藥物如阿塞西普;③通過靶向CD28抑制T細胞活化的藥物,如貝拉西普(批準用于同種異體移植排斥)或阿巴西普(批準用于類風濕性關節炎);④抑制 IL8 (ABX-IL8) 或 IL8 受體的藥物如克霉唑;⑤抑制 NF-κB 通路的藥物,例如已經處于腎小球疾病臨床試驗中的巴多索隆。在IgAN中一些致病基因(如 CARD9、ITGAX、PF4V1、CFHR1 或 FCAR)尚無有效的藥物抑制劑。部分基因編碼具有保護性的分泌蛋白,例如 FCRL3 和 TNFSF4,這表明針對它們的上調可能會提供合理的治療策略。這些研究發現了重要的疾病靶標,從而為開發出特異性更強的新藥指明方向,同時為不同疾病相同信號通路中的老藥新用提供依據。但是,仍然需要進行機制研究首先確認靶基因的正確性和致病機制。

5 總結和展望

繼 2010年第一個IgAN的GWAS報道之后,隨著GWAS的樣本量的增加和功能性變異研究的開展,大量的與IgAN相關的易感性位點和其生物學功能逐漸被揭示。未來需要整合遺傳、臨床和生物信息學數據集的工作來進一步闡明IgAN的發病機制。首先,全面檢測遺傳變異對于揭示 IgAN 的發病機制至關重要。迄今為止發現的風險位點解釋了11%的疾病風險。通過對更大的樣本量進行GWAS,使用基于插補的薈萃分析,對IgAN和自身免疫或炎癥相關疾病進行交叉表型遺傳分析,可能有望全面揭示其遺傳背景。不同于GWAS鑒定的位點多為常見的非編碼區變異,全外顯子測序和全基因組測序可以來識別罕見變異,可能解釋復雜性狀中遺傳力缺失的部分。其次,對于已確定的位點,使用生物信息學方法解釋其功能非常重要,包括公共數據庫的計算機分析,通路分析和功能驗證。第三,也許最重要的顧慮是IgAN的特征是顯著異質性的病理和臨床表現,需要有IgAN更精細的表型表征,以幫助預測治療和預后意義。所以未來GWAS 的研究是對更精細表型的生物學闡釋,將遺傳學與生物學聯系起來,開發基于遺傳信息的藥物治療,改進臨床風險預測,并確保這些對疾病產生積極影響。