血清可溶性CD276與晚期高級別漿液性卵巢癌預后及腫瘤免疫浸潤相關性分析

蔣 艷,黎雪梅,鄒吳春,任 麗,何 春,陽袁莉

(1.四川大學華西醫院資陽醫院/資陽市第一人民醫院婦科,四川 資陽 641300;2.成都市婦女兒童中心醫院婦產科,四川 成都 610000)

以卵巢癌為代表的婦科疾病被稱為是導致女性死亡的婦科腫瘤三大殺手之一,在發展中國家屬于最常見的婦科惡性腫瘤[1]。高級別漿液性卵巢癌(advanced high-grade serous ovarian cancer,HGSOC)是上皮性卵巢癌的常見亞型之一,因其具有典型的組織學和分子學異質性,檢測手段缺乏特異性,患者因感不適就診時多已至中晚期[2]。目前卵巢癌的發病率控制方面的進展甚微,且越來越呈年輕化趨勢。最近有學者指出,腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TILs)通過某些途徑參與腫瘤的發生、發展,如從血管滲出進入實體瘤微環境的CD8+細胞,其水平表達與結直腸癌的微血管密度密切相關,聯合靶向治療促進CD8+細胞水平能達到抗血管生成的目的[3];作為B7家族的跨膜蛋白B7-H3(CD276),其在腫瘤微環境的調節中起著復雜作用,能直接作用于靶細胞作為免疫檢查點,同時還可能參與癌細胞的胞內信息傳遞,為眾多腫瘤的潛在治療靶點提供了可能性[4]。但目前關于血清CD276與HGSOC臨床結局的關系尚存在爭議。本研究收集73例晚期HGSOC患者的臨床資料,旨在分析血清可溶性CD276(sCD276)對晚期HGSOC患者免疫環境的影響及與預后的關系,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入標準:①臨床資料完整,所有受試者均能配合隨訪;②術前為進行放療、靶向、免疫和化療等治療;③HGSOC均為原發性病變,病理分期為IIIc期及IV期。排除標準:①有血液系統疾病和自身免疫性疾病;②合并重大臟器損傷等影響實驗結果的并發癥;③存在其他惡性腫瘤和全身感染者;④存在認知功能障礙和精神疾病者;⑤卵巢癌復發者;剔除標準:①未能定期隨訪者;②隨訪時間不足者;③實驗室檢查結果不完整的受試者。將2017 年3 月至2020 年3 月于資陽市第一人民醫院就診的晚期HGSOC患者73 例納入A組,年齡42～78 歲[(62.75±6.24)歲];根據國際婦產科聯盟臨床分期[5]分為IIIc期42例、IV期31例;有淋巴結轉移57 例,無淋巴結轉移16 例。選取同期入院治療的其他類型卵巢癌患者80 例納入B組,年齡41～76 歲[(62.24±7.27)歲],根據疾病類型分為子宮內膜樣癌32 例,黏液性癌24 例,透明細胞癌17 例,低級別漿液性癌7 例;臨床分期分為IIIc期48 例、IV期32 例;根據有無淋巴結轉移可分為:有淋巴結轉移60 例,無淋巴結轉移20 例。另選擇80 名健康人群作為健康人群組,年齡43 歲～72 歲[(62.53±6.58)歲]。三組受試者的年齡、臨床分期、淋巴結轉移情況比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得醫學倫理委員會同意批準,受試者同意接受治療并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1血清指標的檢測 三組受試者均于清晨空腹采集外周靜脈血3 ml,進行離心處理(3000 r/min,10min),凝固分離得到血清,采用酶聯免疫吸附法檢測血清sCD276的表達水平。

1.2.2組織標本獲取及檢測 收集所選晚期HGSOC患者術后癌中間組織、距腫瘤邊緣約5 cm癌旁組織制作成標本,采用免疫組化法進行檢測,將標本置于10%甲醛溶液中固定,后經石蠟包埋處理后制成5 μm的切片標本,檢測細胞表面CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+和調節性叉頭狀轉錄因子P3(regulatory forkhead transcription factor P3,FoxP3+)的表達。將其編碼并在70 ℃烤箱中烘干,后加入二甲苯液脫蠟、95%乙醇浸泡水化處理、高溫高壓抗原修復等一系列操作后,加入鼠抗人單克隆抗體作為一抗,按照試劑盒合適比例稀釋,保證一抗溶液能完全覆蓋切片標本,再37 ℃孵育1 h,使用磷酸緩沖溶液清洗后甩干玻片,于組織中央加入二抗,在25 ℃下孵育1 h,使用磷酸緩沖溶液清洗后滴加現配的二氨基聯苯胺染色液,再清水沖洗二氨基聯苯胺染色液后將玻片置于蘇木素染液中浸潤復染,最后切片梯度酒精脫水(濃度依次為75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇),脫水后置于二甲苯中透明處理,中性樹膠封片,蓋玻片覆蓋晾干處理。使用光學顯微鏡高倍視野下觀察切片,磷酸緩沖溶液代替一抗作為空白對照。陽性結果染色強度由弱至強評分:0 分(無著色)、1 分(淺黃色)、2 分(棕黃色)、3 分(棕褐色)。陽性細胞比例評分:0分(0～5%)、1分(6%～25%)、2 分(26%～50%)、3 分(51%～75%)、4分(76%～100%)。將染色強度評分×陽性細胞比例評分的總分作為最終分值[6]:0 分為陰性(-),1～5 分為弱陽性(+),6～9 分為中度陽性(++),10～12 分為強陽性(+++),綜合評價最終分值<5分為CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+和FoxP3+陰性,最終分值≥5分為CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+、CD276+和FoxP3+陽性。CD276以腫瘤細胞膜免疫反應陽性為標志。

1.3 隨訪指標通過門診、電話或住院方式對腫瘤患者第1 年至少每3 個月隨訪1 次,第2～3年至少每6 個月隨訪1 次,持續隨訪3 年,隨訪終點以患者死亡或失訪為終點事件。其中總生存率定義為初始診斷癌癥時間至死亡或失訪時間,無進展生存期定義為癌癥初始診斷至首次復發或死亡或失訪時間,無病生存率定義為患者腫瘤切除結束至局部復發或死亡或失訪時間。

1.4 統計學方法應用SPSS 26.0統計學軟件分析數據。計量資料用均數±標準差描述,比較采用t檢驗;計數資料用例數(%)表示,比較采用χ2檢驗;采用Kaplan-Meier描繪生存曲線,Cox比例風險回歸進行預后多因素分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組血清sCD276表達水平的比較A組和B組血清sCD276表達水平分別為(496.24±78.85) pg/ml、(403.66±70.47) pg/ml,均高于健康人群組(242.07±25.56) pg/ml(P<0.05),且A組血清sCD276表達水平高于B組(P<0.05)。

2.2 血清sCD276表達水平在卵巢癌患者中的預后表達情況比較將A、B兩組卵巢癌患者依據血清sCD276表達水平中位數進行分組,分為高表達組(≥451.26 pg/ml)和低表達組(<451.26 pg/ml)。A組中低表達組患者的無病生存率及總生存率均高于高表達組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。A組中無病生存時間≥12個月的患者血清sCD276表達水平(214.58±74.10) pg/ml,低于無病生存時間<12個月組(316.61±85.27) pg/ml,差異有統計學意義(t=4.96,P<0.05)。

表1 A組不同血清sCD276表達水平患者的無病生存率、總生存率比較 (%)

2.3 A組不同血清sCD276表達水平患者的臨床特征比較A組患者依據血清sCD276表達水平分為sCD276≥451.26 pg/ml組和sCD276<451.26 pg/ml組。兩組患者在年齡、有無絕經、臨床分期、CA125水平、BRCA基因突變、有無新輔助化療、有無CD4+、CD8+、CD80+、CD86+陽性等方面比較,差異無統計學意義(P>0.05);兩組在有無淋巴結轉移、有無術后殘余病灶、有無CD3+陽性、FoxP3+陽性等方面比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 A組不同血清sCD276表達水平患者的臨床特征比較[n(%)]

2.4 影響晚期HGSOC患者預后的多因素Cox回歸分析將HGSOC患者預后作為因變量,以有淋巴結轉移、有術后殘余病灶、CD3+陽性、FoxP3+陽性、血清sCD276≥451.26 pg/ml作為自變量,經多因素COX風險回歸分析得出,有術后殘余病灶、CD3+陽性、FoxP3+陽性、血清sCD276≥451.26 pg/ml均是晚期HGSOC患者預后的危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響晚期HGSOC患者預后的多因素Cox回歸分析

2.5 腫瘤組織膜CD276不同表達亞組患者中血清sCD276及TILs的表達情況經免疫組化法對腫瘤組織檢測得出,A組中有59例患者膜CD276表達為陽性,14例患者膜CD276表達為陰性。膜CD276陽性組的血清sCD276表達及FoxP3+陽性比例均明顯高于膜CD276陰性組(P<0.05),兩組CD3+陽性、CD4+陽性、CD8+陽性、CD80+陽性、CD86+陽性比例等指標比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 腫瘤組織膜CD276不同表達亞組患者中血清sCD276及TILs的表達情況比較

3 討論

卵巢癌在中國女性常見癌癥中排名第三位,5年生存率為30%～40%[7]。近幾年,臨床學術界迎來了免疫逃逸學熱潮,主要是研究人體免疫系統和惡性腫瘤關聯的惡性生物學行為[8]。CD276是一種I型跨膜蛋白,基于蛋白序列的相似性,被認為是B7家族的免疫檢查點成員,在腫瘤領域獲得了廣泛關注[9]。迄今為止,有多數研究闡述稱,CD276的促腫瘤功能與腫瘤生長、葡萄糖和脂肪酸代謝、細胞遷移、轉移、藥物和化療抗性等有關[10,11]。也有學者表示,CD276抑制了T細胞的細胞毒性,這種細胞毒性允許腫瘤的增殖和轉移[12]。本研究從sCD276著手,探討其與晚期卵巢癌的聯系。

在本研究中,高血清sCD276表達是晚期HGSOC患者復發或死亡的危險因素之一,同時還比較了晚期HGSOC患者腫瘤組織膜CD276表達情況與TILs的關系,發現膜CD276水平的增高與FoxP3+細胞浸潤數量有一定相關性。這提示CD276在晚期HGSOC患者中有免疫調節作用。盡管大多數正常人體組織都有CD276 mRNA表達,但CD276蛋白的表達在健康人群細胞中通過嚴格的轉錄調控后是高度保守的,而其在許多腫瘤中通常以細胞外形式過度表達和升高,這說明腫瘤細胞獲得了破壞CD276轉錄后調節的能力[13],因此血清sCD276或許能成為腫瘤免疫浸潤的新型非侵入性分子標志物。

臨床試驗證明,PD-1/PD-L1抗體僅在25%左右的復發性卵巢癌患者中觸發客觀腫瘤反應,PD-1/PD-L1抑制治療對卵巢癌的療效有限,免疫治療尚未成為標準治療方案[14～16]。目前為止尚未發現與高應答率相關性強的生物分子標志物,雖然對于PD-1/PD-L1抑制治療存在應答反應的患者,腫瘤細胞中和免疫細胞中可通過PD-L1表達情況進行評估,但其也存在局限性,需要結合病理學樣本進行,同時還可能因為腫瘤的異質性,并不能保證病理學樣本一定能反映疾病情況[17～19]。因此,除了PD-1/PD-L1抑制治療外,還需尋求新的方法來針對晚期HGSOC中免疫多樣性腫瘤微環境。血清sCD276作為腫瘤免疫浸潤的替代標志物,除了作為一種免疫檢查點分子外,還用于晚期HGSOC的腫瘤微環境免疫抑制治療試驗。國外有學者選取了147對晚期HGSOC匹配的樣本,并用組織學、免疫組織化學和深入的DNA/RNA測序評估了新輔助化療對晚期HGSOC免疫應答的影響,發現新輔助化療增加了晚期HGSOC免疫浸潤程度,導致大量CD8+T細胞表達,增強了免疫活性[20]。因此,血清sCD276作為腫瘤免疫浸潤的替代分子標志物,為晚期HGSOC新輔助化療期間的免疫應答監測提供了可能性,臨床醫師可考慮在化療實施后依據晚期HGSOC腫瘤免疫浸潤程度實時聯合免疫抑制療法來改善患者預后。

本研究選取了同期住院治療的其他病理類型晚期卵巢癌進行對比,結果顯示A組與B組的無病生存率比較差異無統計學意義(P>0.05),提示血清sCD276與除晚期HGSOC病理類型的晚期卵巢癌的預后無相關性。同時本研究結果顯示膜CD276陽性組血清sCD276≥451.26 pg/ml、FoxP3+陽性的比例均明顯高于膜CD276陰性組(P<0.05),同時經多因素Cox風險回歸分析模型提示,血清sCD276≥451.26 pg/ml、FoxP3+陽性是晚期HGSOC患者復發或死亡的危險因素。

綜上,血清sCD276在晚期HGSOC呈高表達水平,其水平升高與TILs標志物FoxP3+T細胞數量均是晚期HGSOC患者復發或死亡的危險因素,與患者預后關系密切,同時血清sCD276除了作為一種免疫檢查點分子外,還為晚期HGSOC新輔助化療期間的免疫應答監測提供了可能性。本研究亦存在不足,研究納入樣本量少,隨訪時間較短,實驗結果可能受樣本數量、地域性差異影響,使結果存在誤差,故為推動后續研究進一步深入,還需增加樣本量、豐富病例的地域性,實施更長時間、更大規模的動態隨訪。