黑果腺肋花楸果制劑中有效成分測定及體外活性研究

陳 浩，王曉林，鐘方麗，劉君宇，劉 波，孟 澳

（吉林化工學院，吉林吉林 132022）

黑果腺肋花楸Aronia melanocarpa屬薔薇科腺肋花楸屬灌木，又稱野櫻莓［1］，果實具有多種活性成分［2］，文中簡稱黑果.2018年國家衛健委將黑果列為新食品原料［3］.黑果具抗氧化、控制血糖、改善血脂、抗炎、抗腫瘤等功效［4-5］.刺玫果Rosa davuricaPAII.系薔薇科薔薇屬植物山刺玫的成熟果實［6］，富含黃酮、多糖、鞣質等成分，具有抗衰老、抗疲勞、保護心血管等藥理作用［7］，并且毒副作用小.黑果和刺玫果在食品、藥品和保健品領域皆被廣泛研究與應用.

顆粒劑指原料藥物與適宜的輔料混合制成具有一定粒度的干燥顆粒狀制劑［8］.為確保黑果腺肋花楸果制劑穩定性好、運輸、攜帶和貯藏方便［9］，我們對其顆粒劑進行了研究.黑果顆粒劑是以黑果為單一原料，與適宜的添加劑制成的顆粒狀功能性食品，而雙果顆粒劑是將黑果與刺玫果兩種原料合用，與適宜的添加劑制成的一種全新的顆粒狀功能性食品.

本實驗組在前期工作的基礎上，建立了制劑中總黃酮、原花青素、花色苷和多糖的含量測定方法，并進行了方法學驗證，以制定該制劑的質量標準.另外對其體外清除亞硝酸鹽能力，抑制脲酶、α-葡萄糖苷酶和抑制胰脂肪酶的活性進行考察，為黑果腺肋花楸果制劑在食品方面的研究及開發提供實驗依據.

1 實驗材料、試劑與儀器

本實驗所用材料黑果購自吉林省黑果花楸科技有限公司，刺玫果購自安徽亳州醫藥總公司.

實驗所用試劑有原花青素、蘆丁、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品（成都曼思特生物科技有限公司），尿素酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶、對硝基苯磷酸二鈉鹽（p-Nitrophenyl phosphate，p-NPP）（生化級，上海寶曼生物科技有限公司），4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrobenzophenone-α-D-glucopyr anoside，PNPG）（生化級，北京夢怡美生物科技有限公司），其他試劑均為國產分析純.

實驗儀器主要有H1850型臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），TU-1810型紫外可見分光光度計、TU-1950 型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）和PL-9602型酶標儀（北京普朗新技術有限公司）等.

2 實驗方法

2.1 有效成分的質量測定

2.1.1總黃酮的質量測定

采用硝酸鋁比色法［10］繪制蘆丁標準曲線，線性方程y=0.013 72x-0.025 93（R2=0.999 2）.測定樣品溶液的吸光度值并計算質量濃度，按式（1）計算總黃酮的質量.

式中：X1為樣品中總黃酮的質量，mg；C1為樣液中總黃酮質量濃度，μg/mL；V1為樣液體積，mL；N1為稀釋倍數；10-3為將μg換算成mg.

2.1.2原花青素的質量測定

采用鐵鹽催化比色法［11］繪制原花青素標準曲線，線性方程y=2.020 95x-0.013 46（R2=0.999 3）.測定樣品溶液的吸光度值并計算質量濃度，按式（2）計算原花青素的質量.

式中：X2為樣品中原花青素的質量，mg；C2為樣液中原花青素質量濃度，mg/mL；V2為樣液體積，mL；N2為稀釋倍數.

2.1.3花色苷的質量測定

采用亞硫酸鈉漂白法［12］繪制矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準曲線，線性方程y=0.032 23x+0.002 86（R2=0.999 5）.測定樣品溶液的吸光度值并計算質量濃度，按式（3）計算花色苷的質量.

式中：X3為樣品中花色苷的質量，mg；C3為樣液中花色苷質量濃度，μg/mL；V3為樣液體積，mL；N3為稀釋倍數；10-3為將μg換算成mg.

2.1.4多糖的質量測定

采用苯酚-硫酸法［13］繪制葡萄糖標準曲線，線性方程為y=12.769 54x-0.038 86（R2=0.999 4）.測定樣品溶液的吸光度值并計算質量濃度，按式（4）計算多糖的質量.

式中：X4為樣品中多糖的質量，mg；C4為樣液中多糖質量濃度，mg/mL；V4為樣液體積，mL；N4為稀釋倍數.

2.2 黑果顆粒劑和雙果顆粒劑的制備

2.2.1黑果顆粒劑的制備

根據參考文獻［14］，將干燥后的黑果浸膏研磨成粉末，加入適量的乳糖、可溶性淀粉和蔗糖混合、制粒、干燥、整粒，制得3批黑果顆粒劑，備用.

2.2.2雙果顆粒劑的制備

根據參考文獻［15］，將干燥后的雙果浸膏研磨成粉末，加入適量的羧甲纖維素鈉、甘露醇混合、制粒、干燥、整粒，制得3批雙果顆粒劑，備用.

2.3 樣品有效成分的含量測定

各取兩種顆粒劑研磨為細粉后，分別稱取樣品1.0 g于容量瓶中，加入適量甲醇（或水），超聲使其溶解，加入相應溶劑至刻度，離心，將上清液作為樣品溶液，測定，分別計算兩種顆粒劑中總黃酮、原花青素、花色苷和多糖的含量.

2.4 方法學驗證

2.4.1穩定性實驗

顯色前穩定性：取樣品溶液適量，分別于配制后0、30、60、120、180、240、300、360 min 進行測定，同“2.1”方法測定不同有效成分吸光度并計算RSD.

顯色后穩定性：取樣品溶液適量，分別同“2.1”方法顯色后0、10、20、30、40、50、60 min 進行測定，測定不同有效成分吸光度并計算RSD.

2.4.2重復性實驗

分別精密吸取樣品溶液適量，同“2.1”方法后測定不同有效成分，連續6 次，記錄吸光度并計算RSD.

2.4.3精密度實驗

分別精密吸取樣品溶液適量6 份，同“2.1”方法后經2 人在不同儀器上分別測定不同有效成分吸光度，記錄吸光度并計算RSD.

2.4.4加樣回收率實驗

稱取已知含量的樣品6 份，每份樣品中加入相應的對照品適量，同“2.3”操作，制備6 份樣品溶液，按照“2.1”方法測定不同有效成分的吸光度，計算總黃酮、原花青素、花色苷和多糖的平均回收率及RSD.

2.5 黑果顆粒劑和雙果顆粒劑的含量測定

取3批黑果顆粒劑和雙果顆粒劑，同“2.3”操作，測定不同有效成分吸光度，計算總黃酮、原花青素、花色苷和多糖的含量平均值.

3 制劑的體外活性研究

3.1 清除亞硝酸鹽能力的測定

根據參考文獻［16］的方法，略加改動，分別吸取不同質量濃度樣品溶液1 mL 進行試驗，分別在538 nm處測定A0、Ai、Aj.按式（5）計算樣品對亞硝酸鹽清除率.

式中：A0為未加樣品溶液吸光度值，Ai為加入樣品吸光度值，Aj為對照吸光度值.

3.2 脲酶活性抑制率的測定

參考文獻［17］的方法，略加改動，分別每個孔加入25μL脲酶溶液，再加入25μL不同質量濃度的樣品溶液或加入25μL磷酸緩沖溶液.分別在630 nm處測定A樣品、A空白、A對照.按式（6）計算樣品對脲酶活性抑制率.

式中：A樣品為加入樣品溶液吸光度值，A空白為不加樣品和尿素溶液吸光度值，A對照為不加樣品溶液吸光度值.

3.3 α-葡萄糖苷酶活性抑制率的測定

參考文獻［18］的方法，略加改動，按各反應液組成進行試驗，分別在405 nm測定A樣品、A背景和A空白.按式（7）計算樣品α-葡萄糖苷酶活性抑制率.

式中：A空白為不加待測樣品的吸光度，A樣品為加入樣品溶液的吸光度，A背景為酶溶液用緩沖溶液代替的吸光度，保持其他條件不變.

3.4 胰脂肪酶活性抑制率的測定

參考文獻［19］的方法，略加改動，在微孔板中每個孔加入20μL 磷酸鹽緩沖液（pH6.8）或20μL 不同質量濃度的樣品溶液進行試驗，分別在405 nm 測定Ai1、A1、Ai0和A0.按式（8）計算樣品胰脂肪酶抑制率.

式中：Ai1為加樣品溶液實驗組吸光度值，A1為不加胰脂肪酶溶液實驗空白組吸光度值，Ai0為不加樣品溶液對照組吸光度值，A0為不加樣品溶液和胰脂肪酶溶液空白組吸光度值.

4 結果與分析

4.1 方法學驗證的實驗結果

4.1.1樣品有效成分含量測定的實驗結果

黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷和多糖的含量分別為7.29、14.11、1.65、486.92 mg/g和12.34、3.46、0.81、706.11 mg/g.

4.1.2穩定性的實驗結果

如表1、表2所示，數據得出黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖均在顯色前360 min 內和顯色后60 min 內有良好的穩定性，且RSD＜3.0%，可滿足含量測定的要求.

表1 顯色前穩定性的實驗結果

表2 顯色后穩定性的實驗結果

4.1.3重復性的實驗結果

如表3所示，黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖的吸光度值RSD≤1.0%，說明此測定方法重復性好.

表3 重復性的實驗結果

4.1.4精密度的實驗結果

如表4所示，黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖吸光度值RSD＜2.0%，表明此測定方法精密度良好，可以滿足含量測定要求.

表4 精密度的實驗結果

4.1.5加樣回收率的實驗結果

如表5所示，黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖的加樣回收率分別為98.63%～102.50%和98.27%～103.00%，且RSD＜2.0%，表明此測定方法加樣回收率良好.

表5 黑果顆粒劑加樣回收率的實驗結果

表6 雙果顆粒劑加樣回收率的實驗結果

4.1.6黑果顆粒劑和雙果顆粒劑含量測定的實驗結果

如表7 所示，3 批黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖的含量平均值分別為7.27、14.10、1.56、473.95 mg/g和12.35、3.44、0.80、700.12 mg/g.

表7 黑果顆粒劑和雙果顆粒劑含量測定的實驗結果

4.2 體外活性研究的實驗結果

4.2.1清除亞硝酸鹽能力的實驗結果

黑果顆粒劑線性方程為y=11.676 3x+34.020 3（R2=0.992 4）.雙果顆粒劑線性方程為y=10.973 8x+30.434 5（R2=0.968 2）.Vc對照線性方程為y=13.614 6x+34.299 6（R2=0.985 8）.根據上述線性方程可知，黑果顆粒劑、雙果顆粒劑、Vc的IC50值為1.37、1.78、1.15 mg/mL.樣品對亞硝酸鹽均具有一定清除能力，在一定的條件下，其能力大小為Vc＞黑果顆粒劑＞雙果顆粒劑.

4.2.2脲酶活性抑制率的實驗結果

黑果顆粒劑線性方程為y=13.731 5x+31.904 5（R2=0.992 1）.雙果顆粒劑線性方程為y=16.455 8x+20.114 6（R2=0.988 7）.根據上述線性方程可知，黑果顆粒劑和雙果顆粒劑的IC50值為1.32 mg/mL和1.82 mg/mL.樣品對脲酶活性均具有一定抑制能力，在一定的條件下，其能力大小為黑果顆粒劑＞雙果顆粒劑.

4.2.3α-葡萄糖苷酶活性抑制率的實驗結果

黑果顆粒劑線性方程為y=12.494 0x+31.843 4（R2=0.981 6）.雙果顆粒劑線性方程為y=11.888 1x+32.817 7（R2=0.985 6）.阿卡波糖線性方程為y=15.193 8x+33.706 1（R2=0.981 2）.根據上述線性方程可知，黑果顆粒劑、雙果顆粒劑、阿卡波糖的IC50值為1.45、1.44、1.07 mg/mL.樣品對α-葡萄糖苷酶活性均具有一定抑制能力，在一定的條件下，其能力大小為阿卡波糖＞雙果顆粒劑＞黑果顆粒劑.

4.2.4胰脂肪酶活性抑制率的實驗結果

黑果顆粒劑線性方程為y=15.809 6x+25.582 7（R2=0.978 5）.雙果顆粒劑線性方程為y=15.466 7x+19.011 2（R2=0.968 4）.根據上述線性方程可知，黑果顆粒劑、雙果顆粒劑的IC50值為1.54 mg/mL 和2.00 mg/mL.樣品對胰脂肪酶活性均具有一定抑制能力，在一定的條件下，其能力大小為黑果顆粒劑＞雙果顆粒劑.

5 結論

由實驗數據得出，黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖均在顯色前360 min 內和顯色后60 min 內有良好的穩定性，重復性RSD≤1.0%，精密度RSD＜2.0%，加樣回收率分別為98.63%～102.50%和98.27%～103.00%，且RSD＜2.0%，經方法學驗證可以滿足制劑中含量測定要求.3 批黑果顆粒劑和雙果顆粒劑中有效成分總黃酮、原花青素、花色苷、多糖的含量平均值分別為7.27、14.10、1.56、473.95 mg/g和12.35、3.44、0.80、700.12 mg/g.

根據體外活性實驗結果可知，兩種顆粒劑均具有清除亞硝酸鹽的能力、抑制脲酶活性、α-葡萄糖苷酶活性、胰脂肪酶活性的能力，預示著黑果制劑可能具有抗腫瘤活性、降低尿酸的活性、降低血糖的活性、抑制甘油三酯吸收的活性.本文建立的兩種顆粒劑中4 類有效成分總黃酮、原花青素、花色苷和多糖的含量測定方法，可為黑果腺肋花楸制劑的質量控制提供依據，為黑果制劑后續的上市開發提供依據.