一測多評法同時測定化肝煎中5種成分及其質量評價*

羅曼 張武崗, 喻文韜 吳歡 姚閩,4 馮育林, 楊世林**

(1.江西中醫藥大學,江西 南昌 330006;2.中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心,江西 南昌 330006;3.江西本草天工科技有限責任公司,江西 南昌 330006;4.江西省藥品檢驗檢測研究院,江西 南昌 330006)

化肝煎由青皮、陳皮、白芍、牡丹皮、梔子(炒)、澤瀉、貝母組成,最早記載于明代張景岳的《景岳全書》[1],2018年4月被收載入《古代經典名方目錄(第一批)》[2]。目前多用于治療因肝氣上逆致肝胃不和引起的消化系統疾病和婦科類疾病[3-7]。目前,關于化肝煎的多成分質量控制方法研究報道較少,聶欣等[8]建立了化肝煎中芍藥苷、橙皮苷和丹皮酚3種成分含量分別測定的HPLC方法;楊雪穎等[3]通過建立2種HPLC方法來分別控制化肝煎中梔子苷、丹皮酚和芍藥苷3種成分的含量;郭中華等[9]建立了化肝煎中沒食子酸、梔子苷、芍藥苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷5種成分含量的HPLC測定方法。為了更加簡便、快捷的對化肝煎的質量進行評價,本研究擬建立化肝煎多成分質量控制的QAMS法,以期為化肝煎的后續開發及質量評價提供參考。

QAMS法是以內標法、外標法(External Standard Method,ESM)、校正因子法等分析方法為基礎的延伸,該方法以藥物本身所具有的成分為參照,同步進行多個成分含量的測定,不僅解決了在質量控制時,對照品價高和難得的問題,還能更加準確地反映整個處方的質量狀態[10-13]。因此,本研究擬以Nari作為參照,建立化肝煎中Gal、Geni、Nari、Hesp和Paeo 5種成分含量的QAMS法,同時利用化學模式識別分析方法對化肝煎不同批次樣品的檢測結果進行評價[14],以期為該處方的后續開發及質量評價提供一種更為簡便的方法。

1 材料

1.1儀器 LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津);JM-B50002電子天平(余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司); MS205DU電子分析天平(METTLER TOLEDO科技有限公司);康雅順電陶爐(康雅順電器有限公司);KQ5200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HWS-24型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2試劑與試藥 陳皮(批號:20201101-5,江西南豐)、青皮(批號:20190601-5,江西吉安)、白芍(批號:201907011-5,浙江磬安)、牡丹皮(批號:1909011-5,四川蒼溪)、梔子(批號:20201111-5,江西)、澤瀉(批號:20200311-5,福建南平)、浙貝母(批號:20200311-5,浙江磬安縣)各5批;以上七味藥經江西省藥品檢驗檢測研究院高級工程師姚閩鑒定。

橙皮苷(批號:110721-202019,質量分數:95.3%),沒食子酸(批號:110831-201906,質量分數:91.5%),梔子苷(批號:110749-201919,質量分數:97.1%),丹皮酚(批號:110708-201908,質量分數:99.8%),以上對照品均購自于中國食品藥品檢定研究院;蕓香柚皮苷(批號:YY-071-190329,質量分數:98%),購自成都瑞芬思生物科技有限公司;甲醇(色譜級,Fisher);磷酸(色譜級,Fisher);純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

2 方法與結果

2.1溶液制備

2.1.1對照品溶液 精密稱取Gal、Geni、Nari、Hesp和Paeo,以甲醇為溶劑配制質量濃度分別為0.1601、2.1900、1.8030、0.7205和0.1616 mg·mL-1的對照品溶液。同時配制一份Gal、Geni、Nari、Hesp和Paeo質量濃度分別為0.0021、0.0219、0.0060、0.0068和0.0030 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液 稱取青皮(20190605)7.50 g,陳皮(20201101)7.50 g,白芍(201907015)7.50 g,牡丹皮(1909013)5.63 g,梔子(20201112)5.63 g,澤瀉(20200311)5.63 g,浙貝母(20200714)10.00 g,置煎藥壺中,加水300 mL,浸泡30 min,以武火煮沸,轉文火煎煮40 min,趁熱過濾,即得標準煎液。精密吸取標準煎液10 mL于50 mL容量瓶內,加甲醇定容至刻度線,即得供試品溶液。

2.1.3陰性樣品溶液 參照“2.1.2”項分別制備缺青皮;缺陳皮;缺梔子;缺牡丹皮;缺青皮和陳皮;缺青皮、陳皮、牡丹皮和梔子;缺青皮、陳皮、牡丹皮、梔子和白芍的陰性樣品溶液。

2.2色譜條件 色譜柱:Welch C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-0.1%的磷酸水,洗脫時間程序如表1所示;柱溫40 ℃;流速1.0 mL·min-1;檢測波長270 nm;進樣量10 μL。

表1 HPLC梯度洗脫表

2.3方法學考察

2.3.1專屬性實驗 取“2.1.1”項下混合對照品、“2.1.2”項下供試品溶液和“2.1.3”項下七種陰性樣品溶液各適量,按“2.2”項的色譜條件進樣測定,結果如圖1所示,5種成分色譜峰的分離度均大于1.5,且陰性樣品對Gal、Geni、Nari、Hesp和Paeo 5種成分的含量測定沒有干擾,表明該方法專屬性良好。

注：A.對照品溶液;B.供試品溶液;C.缺青皮陰性樣品;D.缺陳皮陰性樣品;E.缺梔子陰性樣品;F.缺牡丹皮陰性樣品;G.缺青皮、陳皮陰性樣品;H.缺青皮、陳皮、梔子和牡丹皮陰性樣品;I.缺青皮、陳皮、梔子、牡丹皮和白芍陰性樣品;1.Gal;2.Geni;3.Nari;4.Hesp;5.Paeo

2.3.2線性關系考察 將“2.1.1”項下對照品溶液分別稀釋成5個濃度梯度,按“2.2”項的色譜條件分別進樣測定。橫坐標(X)為各成分質量濃度(mg·mL-1),縱坐標(Y)為各成分峰面積,得到各成分的回歸方程和線性范圍如表2所示,Gal、Geni、Nari、Hesp和Paeo分別在各自的范圍內線性關系良好,R2均在0.9992～0.9999之間。

表2 各成分線性關系與范圍

2.3.3精密度實驗 將“2.1.1”項下混合對照品溶液按“2.2”項的色譜條件連續進樣六次,測得Gal、Geni、Nari、Hesp和Paeo含量的相對標準偏差(RSD)值分別為0.25%、0.23%、0.22%、0.30%和0.30%,均小于1.00%,表明該儀器精密度良好。

2.3.4重復性實驗 按“2.1.2”項下的方法平行制備同批次6份供試品溶液,分別按“2.2”項的色譜條件進樣測定,測得Gal、Geni、Nari、Hesp和Paeo含量的RSD值分別為2.27%、1.77%、0.29%、0.57%和0.34%,均小于3.00%,表明該方法重復性良好。

2.3.5穩定性實驗 吸取同一份供試品溶液,按“2.2”項的色譜條件,分別于0、4、8、12、16、24 h進樣測定。測得Gal、Geni、Nari、Hesp和Paeo含量的RSD值分別為0.25%、2.19%、0.33%、0.50%和0.33%,均小于3.00%,表明該供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.6加樣回收實驗 參照“2.1.2”項下方法制備兩份供試品溶液,精密量取6份標準湯劑,每份2 mL,分別以1∶0.8、1∶1、1∶1.2的比例加入對照品粉末,加入適量甲醇,超聲使其完全溶解,冷卻至室溫,甲醇定容至10 mL,取上清液,過0.22 μm有機濾頭,按“2.2”項的色譜條件進樣測定,測各成分加樣回收率和RSD值。結果測得在加樣80%時,Gal、Geni、Nari、Hesp和Paeo的平均加樣回收率分別為96.86%、94.29%、104.0%、93.69%和92.77%;加樣100%時,Gal、Geni、Nari、Hesp和Paeo的平均加樣回收率分別為94.71%、97.53%、105.90%、97.20%和95.04%;加樣120%時,Gal、Geni、Nari、Hesp和Paeo的平均加樣回收率分別為95.46%、92.87%、101.23%、105.8%和97.28%;加樣回收實驗的RSD值均小于3.00%,表明該方法準確可靠。

2.4QAMS法分析

2.4.1相對校正因子測定 相對校正因子(fk/s)計算公式為fk/s=fk/fs=(CkAs)/(CsAk),其中C表示質量濃度,A表示峰面積,S表示參照物,K表示其他成分[11-12,15-18]。精密吸取6份“2.1.1”項下混合對照品溶液,按“2.2”項的色譜條件進樣測定,以Nari為參照,計算其他4種成分的相對校正因子,結果見表3。

表3 各成分的相對校正因子(Nari為參照)

2.4.2不同色譜柱對校正因子的影響 取“2.1.1”項下的對照品溶液,以Nari為參照,在島津色譜儀下考察Welch C18、Diamonsil C18和Cosmosl C18色譜柱對相對校正因子的影響,結果如表4所示,這三種色譜柱對相對校正因子的影響不顯著(RSD<2.00%)。

表4 不同色譜柱對相對校正因子的影響

2.4.3流動相pH對校正因子的影響 取“2.1.1”項下的對照品溶液,以Nari為參照,在島津色譜儀、Welch C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱下,考察不同pH(2.1、2.4、2.7)的流動相對相對校正因子的影響[17-18],結果見表5,從表可知不同pH對相對校正因子的影響不顯著(RSD<1.00%)。

表5 不同pH對相對校正因子的影響

2.4.4不同柱溫對校正因子的影響 取“2.1.1”項下的對照品溶液,以Nari為參照,在島津色譜儀、Welch C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱下,考察不同柱溫(35℃、37℃、40℃、42℃、45℃)對Gal、Geni、Hesp和Paeo 4種成分相對校正因子的影響。結果如表6所示,以Nari為內標物時,不同柱溫對這4種成分的相對校正因子的影響不顯著(RSD<1.00%)。

表6 不同柱溫對相對校正因子的影響

2.4.5色譜峰定位 相對保留時間計算公式tri/s= tRi/tRs[19],tri/s表示相對保留時間,tRi表示其他成分保留時間,tRs表示內標物保留時間,考察其在Welch C18、Diamonsil C18和COSMOSL C18三種不同色譜柱下的重復性。取“2.1.1”項的混合對照品溶液,用島津高效液相色譜儀進樣測定,以Nari為參照,計算其他四種物質的tri/s和RSD。結果如表7所示,采用該方法所計算的各成分相對保留時間的RSD均小于1.50%,即說明該方法適用。

表7 不同色譜柱各成分的相對保留時間值

2.5樣品含量檢測 將5批次化肝煎7味藥材隨機組合成15批處方,按照“2.1.2”項制備方法制得15批供試品溶液(編號S1～S15),按“2.2”項的色譜條件分別采用外標法和一測多評法計算各成分含量,結果如表8所示,兩種方法所測Gal、Geni、Hesp和Paeo 4種成分含量的RSD值均小于3.00%,說明兩種方法測得的各成分含量差異不顯著,QAMS法可靠。同時,測得15批次化肝煎中5種成分的含量均未出現離散值,說明供試品的制備工藝穩定可靠。

表8 15 批次樣品中各成分含量檢測結果(mg·mL-1)

2.6化肝煎化學模式識別分析方法的建立

2.6.1聚類分析 以Nari為參照,將2.5項下15批化肝煎中5種待測成分的QAMS法含量數據導入SPSS 21軟件進行聚類分析,結果顯示,當歐氏距離為15時,15批樣品可分為2大類,S2～S4、S6、S10～S12為一類,S1、S5、S7～S9、S13～S15為一類,其可以評估15批樣品之間的差異。

2.6.2主成分分析(PCA) 以Nari為參照,將2.5項下15批化肝煎中5種待測成分的QAMS法含量數據導入SIMCA 14.1軟件進行PCA分析,在一定程度上可以進一步分析不同批次化肝煎之間的質量差異,并初步分析出造成該差異的成分。PCA模型自動擬合選擇兩個主成分,其累計方差貢獻率為95%(大于85%),表明模型預測良好[14],結果見圖2,15批樣品的分組結果與聚類分析一致,S2～S4、S6、S10～S12為一組,S1、S5、S7～S9、S13～S15為第二組。

圖2 15批化肝煎樣品PCA分布圖

2.6.3偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA) 以“2.5”項下15批化肝煎中5個待測成分的QAMS法含量為變量,通過SIMCA 14.1軟件進行PLS-DA分析,然后對PLS-DA模型進行200次置換檢驗,結果如圖3所示。

圖3 15批化肝煎樣品的PLS-DA模型置換檢驗圖

由圖3可知:擬合直線Y軸的截距為0.0489<0.3,表明所建立的模型結果可靠;Q2擬合直線Y軸截距為-0.2020<0.0500,說明所建立的模型沒有過度擬合,此分析可有效判別分析15批化肝煎的質量差異。再根據變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)分析不同批次樣本中相同成分的影響強度,篩選影響化肝煎質量的標志性成分[13],結果顯示(圖4):Gal、Geni、Nari和Hesp的VIP值均大于1.00,則這4種成分可能是影響該藥質量的標志性成分。

3 討論

3.1色譜條件的選擇 本實驗分別考察了不同流動相、流速、柱溫、檢測波長下化肝煎中5種成分在色譜圖中的分離度、保留時間、峰數量,實驗發現這5種成分在230 nm和270 nm波長下吸收較好,但在230 nm波長下的分離效果不理想;甲醇選擇性雖然弱于乙腈,但甲醇溶劑下峰形更優,雜質沉淀更為完全,0.1%的磷酸水的加入使化肝煎中這5種成分的出峰時間更合適[20],峰形較好;流速在0.9 mL·min-1以上時各成分出峰時間和峰形都比較好,1.00 mL·min-1的峰形最好,所以最終選擇甲醇和0.1%的磷酸水為流動相、柱溫40℃、流速1.00 mL·min-1、進樣量10 μL、檢測波長270 nm作為檢測條件,同時采用梯度洗脫對各成分進行分離和檢測。

3.2檢測指標的選擇 化肝煎具有疏肝理氣、瀉熱和胃之功[21-22]。在指標成分選擇時,根據處方君臣佐使的順序依次進行考慮[23]。青皮和陳皮為君藥[24],其中主要含有Nari和Hesp等成分[25-26]。梔子、牡丹皮和白芍為臣藥[24],梔子中主要含有Geni[27];牡丹皮中主要含有Paeo和Gal[28];白芍中主要含有芍藥苷和Gal等成分[29];但芍藥苷色譜峰的分離度較差,難以和其他物質分離開來,故而本實驗沒有選擇芍藥苷作為檢測指標。澤瀉和浙貝母為佐藥[24],所含的主要成分色譜峰吸收較差,故本實驗未對其進行檢測。同時Gal、Geni、Nari、Hesp和Paeo與化肝煎的藥理活性均存在直接相關性[19],進而最終將這5種成分定為檢測指標。

3.3內標物的選擇 在實驗中發現,Nari性質穩定,線性擬合度較好,色譜峰分離度合適,峰形易辨認,含量也比較高,對照品價格相對比較便宜。所以根據內標物的選擇原則[30-31],本實驗選擇Nari作為參照。

4 結論

本實驗采用QAMS法同時測定化肝煎中Gal、Geni、Nari、Hesp和Paeo的含量,測得這5種成分在各自線性范圍內線性關系良好(R2≥0.999),平均加樣回收率在92%～106%之間,RSD<3.00%;方法的專屬性、精密度、重復性和穩定性良好。Gal、Geni、Hesp和Paeo相對于Nari的校正因子分別是0.2351、13.3223、1.0321、0.1613。QAMS法含量檢測結果與外標法無統計學差異,表明本研究建立的QAMS法較為合理。從聚類分析、主成分分析和偏最小二乘法-判別分析結果可以看出,Gal、Geni、Nari和Hesp是影響化肝煎質量的標志性成分。

綜上所述,本研究所建立的一測多評法和化學模式識別分析可用于化肝煎的質量評價,且該方法簡單便捷,穩定性和重復性好,可為該方的質量控制和評價提供更為全面科學的參考。