華蟾素對HepG2/ADM細胞耐藥的抑制作用及其機制研究*

陳婷 李嘉龍 白蕊 史曉燕 段麗芳 李翠娟,3 范妤,3**

(1.陜西中醫藥大學基礎醫學院,陜西 咸陽 712046;2.陜西中醫藥大學醫學技術學院,陜西 咸陽 712046;3.陜西省中醫體制與疾病防治研究重點實驗室,陜西 咸陽 712046)

肝癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一,病發率和死亡率均位居癌癥前列[1-3]。當前臨床多采用手術、化療、中藥及聯合療法等治療方式。由于多數患者發病隱匿,發現時多已是中后期,使得治療選擇受限,化療成為肝癌患者治療的主要手段[4]。對化療藥物產生多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是化療中常見的棘手現象,極大程度降低了化療藥物治療效果[5]。近年來,多藥耐藥性成為臨床肝癌治療中亟待解決的問題[6-9]。有研究發現,多數化療藥物可以通過誘發腫瘤細胞凋亡發揮抑癌的作用,而腫瘤細胞對化療藥物的抗凋亡作用則是誘發MDR的重要機制之一[10-11]。

華蟾素是由干蟾皮通過水提醇沉法獲得的中成藥制劑,廣泛應用于肝癌[12-15]、肺癌[16-18]、乳腺癌等多種惡性腫瘤[19-21]的臨床治療中,療效顯著。有研究顯示,華蟾素及其有效成分可通過激活線粒體凋亡途徑誘發大腦膠質瘤[22]、淋巴瘤等[23]惡性腫瘤細胞凋亡。華蟾素還可以提高肺癌細胞對化療藥物的敏感性[24],但目前關于華蟾素對肝癌化療中耐藥作用及其作用機制的研究卻鮮有報道。本研究以人肝癌HepG2細胞和阿霉素耐藥細胞株HepG2/ADM為研究對象,從對細胞增殖的影響、細胞內阿霉素積累和凋亡相關蛋白的表達等方面深入探究華蟾素逆轉HepG2/ADM細胞耐藥的機制,旨在為華蟾素的臨床應用提供可靠的理論依據。

1 材料

1.1細胞 人肝癌 HepG2由陜西中醫藥大學晁旭教授惠贈,HepG2/ADM細胞購自廣州吉妮歐生物有限公司(批號:20220723)。

1.2藥物與試劑 將華蟾素膠囊(陜西東泰制藥有限公司,批號:1K0907151)溶于DMSO溶液(DMSO終濃度<0.1%);以DMEM基礎培養基稀釋為相應質量濃度應用于實驗,即用即配[25];阿霉素購于深圳萬樂藥業有限公司(批號:2110E2);青霉素鏈霉素混合液(貨號P1400),胰蛋白酶(貨號:T1300),噻唑蘭(貨號:1334MG250)購自北京Solarbio公司;胎牛血清(貨號:FSP500)購自依科賽生物公司;DMEM 培養基(貨號XT-SH30022,01B)購于美國hyclone公司;Caspase-3一抗(貨號:19677-1-AP)購于美國Proteintech 公司;Caspase-9一抗(貨號:9508S)購于美國 Cell Signaling Technology;BAX一抗(貨號:sc-20067)、Bcl-2 一抗(貨號:sc-56015)購于美國santa cruz公司;β-actin一抗(貨號:bs-0061R)、羊抗兔HRP標記二抗(貨號:BA1135)、羊抗小鼠HRP標記二抗(貨號:BA1050)購自購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.3儀器 高速低溫離心機(Eppendorf 5430R);超低溫冰箱(Thermo Scientific Forma 702);分析天平(中國Mettler Toledo);制冰機(寧波 Grant XB100);渦旋混合器(美國 Scientific Industries);水平搖床(海門 Kylin-Bell BETS-M5);蛋白印跡電泳系統(美國 Bio-Rad);凝膠成像系統(Protein Simple FluorChemFC3);超凈工作臺(蘇州凈化設備);超純水器(美國 Millipore);細胞培養箱(美國 Nuaire NU-4950E);倒置顯微鏡(日本 Olympus)。

2 實驗方法

2.1細胞培養 HepG2細胞于含 12%胎牛血清和 1%雙抗的 DMEM 培養基中培養;HepG2/ADM細胞接種于加入1 μg·mL-1阿霉素的HepG2細胞培養基中,維持細胞的耐藥特性[26]。細胞均置于 37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養箱中孵育,在對數生長期進行后續實驗。

2.2華蟾素對HepG2、HepG2/ADM細胞增殖的影響 分別制備密度為1×105個·mL-1的HepG2、HepG2/ADM細胞懸液,以100 μL/孔接種于96孔板。待細胞貼壁后,給予HepG2細胞含有0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、10 μg·mL-1華蟾素干預;給予HepG2/ADM細胞含有0、1、2、4、8、16、32 μg·mL-1華蟾素干預;繼續培養24 h后,加入20 μL/孔 MTT溶液,避光孵育4 h,棄去液體后加入150 μL/孔 DMSO,室溫震蕩10 min,紫色結晶完全溶解后,全自動酶標儀在490 nm 處測定吸光度(OD)值,計算細胞增殖抑制率=(1-華蟾素組OD值/空白對照組OD值)×100%;計算華蟾素對兩種細胞的半數抑制率(IC50)及藥物的耐藥倍數,耐藥倍數=IC50耐藥株/IC50敏感株[27]。每組6個復孔,重復測定3次。

2.3倒置顯微鏡觀察HepG2/ADM細胞形態學變化 將密度為1×105個·mL-1HepG2/ADM細胞懸液接種于96孔板,100 μL/孔。待細胞貼壁后分別加入0、4、8、16 μg·mL-1華蟾素溶液,繼續培養24 h,倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。

2.4藥物蓄積實驗 把實驗分為HepG2組、HepG2/ADM組、不同濃度華蟾素組。分別將密度為1×104個·mL-1的HepG2細胞和HepG2/ADM細胞,接種于24孔板內,孵育24 h后,HepG2組、HepG2/ADM組加入基礎培養基,不同濃度華蟾素組分別加入含4、8、16 μg·mL-1華蟾素的基礎培養基。繼續培養24 h后,除HepG2組外,其余各組均加入含5 μg·mL-1阿霉素的培養基,孵育4 h,4%多聚甲醛避光固定35 min后加入DAPI染液室溫避光放置5 min,抗熒光淬滅封片劑封片,避光存放。熒光顯微鏡下觀察并拍照。細胞核呈紫藍色熒光,阿霉素自發紅色熒光。采用 ImageJ6.0軟件計算細胞阿霉素熒光強度值。

2.5Western blot實驗檢測凋亡相關蛋白的表達 分組及處理方法同2.4,收集細胞,提取總蛋白,BCA法定量蛋白濃度,制備上樣蛋白,經電泳分離、轉膜、封閉后,分別加入 Bcl-2抗體(1∶1500)、Bax抗體(1∶1000)、Caspase-9抗體(1∶1000)、 Caspase-3抗體(1∶1000)、β-actin抗體(1∶1000),4 ℃孵育過夜;室溫孵育二抗,凝膠成像儀顯影。應用Image J6.0 軟件分析蛋白條帶灰度值。

3 結果

3.1華蟾素抑制HepG2、HepG2/ADM細胞增殖 與空白組比較,華蟾素在0.125至10 μg·mL-1濃度范圍能夠抑制HepG2細胞增殖,統計學差異顯著(P<0.01),IC50為(11.27±1.15)μg·mL-1;華蟾素在1至32 μg·mL-1濃度范圍能夠抑制HepG2/ADM細胞增殖(P<0.01),IC50為(52.60±11.04)μg·mL-1。華蟾素對兩種細胞的增殖抑制作用均具有劑量依賴性。耐藥倍數為4.67。根據華蟾素對HepG2/ADM細胞的增殖抑制情況,選取4、8、16 μg·mL-1作為后續處理劑量。結果見圖1,2。

注:與空白對照組相比**P<0.01

注:與空白對照組相比**P<0.01

3.2華蟾素對HepG2/ADM細胞形態學變化影響 倒置顯微鏡下觀察華蟾素對 HepG2/ADM 細胞形態的影響,結果顯示, HepG2/ADM 細胞形態清晰,有明顯突起,貼壁牢固。經華蟾素干預 24 h后,隨著藥物濃度的增加,細胞數量減少,體積變小,細胞皺縮突起減少,貼壁松散,細胞間連接減少。見圖3。

圖3 華蟾素對HepG2/ADM細胞形態學變化影響(×200)

3.3華蟾素對HepG2/ADM細胞藥物蓄積的影響 與HepG2細胞組比較,HepG2/ADM細胞中ADM的含量無顯著差異(P>0.05)。與HepG2/ADM細胞比較,華蟾素處理組細胞中ADM的含量顯著增加,差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見圖4。

注：與HepG2組相比與##P<0.01;與HepG2/ADM組相比**P<0.01

3.4華蟾素對 HepG2/ADM 細胞凋亡相關蛋白表達的影響 與HepG2細胞組比較,HepG2/ADM細胞中Bcl-2 蛋白表達顯著升高,Caspas e-9 蛋白表達下降(P<0.05),Bax 及 Caspase-3 蛋白表達無顯著變化(P>0.01);與HepG2/ADM細胞比較,華蟾素處理組 Bax、Capase-9 及 Caspase-3 蛋白表達水平顯著升高, Bcl-2 蛋白表達水平降低,差異具有統計學意義(P<0.01)。結果見圖5。

注：與HepG2組相比與#P<0.05,##P<0.01;與HepG2/ADM組相比*P<0.05,**P<0.01

4 討論

全球范圍內,腫瘤疾病已經成為人類重大的公共健康問題之一,在我國肝癌的發病率和死亡率均位居消化系統惡性腫瘤前列[1]。目前臨床治療主要以手術、化療、放療、中藥及聯合治療等,由于肝癌發病隱匿,多數患者失去了手術機會,因此化療成為多數肝癌患者采用的主要治療方案,化療藥物易發生多藥耐藥,使患者對藥物敏感性下降,成為致使化療療效不盡如人意的主要原因之一[9]。

中醫藥是中華文明的瑰寶,來源于天然動植物藥物顯示出良好的抗癌功效。中藥復方、中藥注射液、中藥單體在逆轉肝癌化療耐藥方面機制研究也日益增加。華蟾素是從蟾蜍中提取分離出的主要活性成分,具有抗炎、鎮痛及抗腫瘤等多種功效,對包括肝癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤細胞具有明顯的殺傷作用[24]。

本實驗研究中,我們選用HepG2細胞作為對照,以HepG2/ADM細胞株作為研究對象。MTT實驗結果顯示,華蟾素對HepG2和HepG2/ADM細胞具有顯著的增殖抑制作用,且具有明顯的劑量依賴性;倒置顯微鏡下觀察發現,經華蟾素處理度干預后,隨著藥物濃度的增加,HepG2/ADM細胞數量減少,體積變小,細胞皺縮突起減少,細胞間連接減少,貼壁不牢固,形態學變化與MTT結果相符。

阿霉素(Adriamycin,ADM),也稱多柔比星(Doxorubicin,Dox),是蒽環類家族成員,具有細胞毒性,臨床多作為肝癌及其他腫瘤的一線化療藥。阿霉素穿過細胞膜在細胞內聚集能夠自發紅色熒光,這一特點便于觀察藥物在細胞內的蓄積情況[28]。熒光顯微鏡下觀察顯示,與HepG2和HepG2/ADM細胞相比,華蟾素處理后的HepG2/ADM細胞,胞質中紅色熒光明顯增強增多,表明ADM在HepG2/ADM細胞中含量增加,外排減少,HepG2/ADM對ADM的敏感性增強。

腫瘤細胞對化療藥物產生多藥耐藥的原因和機制復雜,主要與影響凋亡調控的相關蛋白表達、藥物靶點基因突變、酶系統活躍、自噬誘導、ABC 轉運蛋白的高表達等多種因素有關[11]。凋亡蛋白的異常調控是腫瘤細胞產生多藥耐藥的重要原因[29]。多數化療藥物能夠通過誘導肝癌細胞凋亡發揮抑瘤作用。線粒體不僅是細胞凋亡的觸發開關、細胞死亡的直接通路,也與腫瘤多藥耐藥間存在密切關系[26,30]。Western blot實驗結果顯示,經華蟾素處理后,HepG2/ADM細胞中Bax、Caspase-9及Caspase-3蛋白表達水平可顯著上調,Bcl-2 蛋白表達水平顯著下調,表明華蟾素可以通過激活HepG2/ADM線粒體凋亡途徑促進細胞凋亡,抑制HepG2/ADM細胞增殖。

綜上所述,華蟾素對肝癌耐藥細胞具有增殖抑制作用,可以通過增加阿霉素在細胞內蓄積增加、促進耐藥細胞凋亡等方式發揮抗耐藥作用。在后續研究中,我們也將對華蟾素聯合化療藥物應用的療效進行深入的在體和離體實驗研究,為華蟾素在肝癌治療的臨床應用提供新的理論基礎和實驗依據。