超聲波輔助制備藍莓花青素微膠囊的工藝研究

翁 霞,孔 月

(1.鞍山師范學院 化學與生命科學學院,遼寧 鞍山 114007;2.遼寧省天然產物活性分子開發及利用重點實驗室,遼寧 鞍山 114007)

藍莓(VacciniumSpp.)是杜鵑花科越橘屬植物,又稱篤斯越橘.藍莓果實營養豐富,富含花青素、多酚、超氧化物歧化酶等活性成分[1].花青素具有抗氧化、保護視力、保護心血管、增強免疫力等生理功能,開發利用價值高,在食品、醫藥、化妝品等領域有巨大的應用前景[2-3].但是藍莓花青素不穩定,在加工過程中易受pH、溫度、濃度、酶、光照、氧氣、金屬離子等條件影響,因此,如何提高花青素的穩定性成為花青素應用領域的關鍵問題.

微膠囊技術具有保護敏感成分、阻礙物質間的相互作用及延長貯藏時間等優點[4-5].壁材的選擇往往是依據微膠囊產品的最終用途、包埋芯材類型以及具體制備方法來確定[6].GUO等[7]以海藻酸鈉-果膠包裹紫玉米和藍莓提取物,包埋處理明顯降低了花青素色苷的光降解率.CAI等[8]以羥甲基淀粉復合黃原膠為壁材包埋藍莓花青素,發現可以提高藍莓花青素穩定性.DA ROSA等[9]以麥芽糖糊精和玉蜀黍為壁材,采用噴霧干燥法制備藍莓花青素微膠囊,提高了花青素的穩定性.賀博[10]以羧甲基殼聚糖為壁材,研究藍莓花色苷納米微膠囊的制備及其性能,雖然穩定性和釋放率均有所提高,但包埋率相對較低,僅為61.8%.王學瑛等[11]以殼聚糖、海藻酸鈉和多聚磷酸鈉為復合壁材,采用復凝聚-真空冷凍干燥技術等優化工藝制備藍莓花青素微膠囊并將其應用于卷煙中,雖然花青素微膠囊對卷煙感官質量改善效果較為明顯,但微膠囊包埋率相對不高,為76.36%.

鑒于以上研究,本文采用裝置簡單、耗資較少的銳孔法制備微膠囊,以提高包埋率.以藍莓花青素的包埋率為指標,通過單因素試驗、正交試驗、四因素二次回歸正交旋轉組合實驗等方法,比較分析單一海藻酸鈉及其與黃原膠、果膠、羧甲基纖維素鈉、β-環狀糊精等復合壁材對不同濃度藍莓花青素粗提原液包埋效果的影響,篩選出最適的壁材、固化劑及藍莓花青素膠囊的制備工藝,為藍莓花青素微膠囊生產提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓(新鮮市售藍莓,果實飽滿圓潤、大小均勻,果皮顏色在深紫色和藍黑色之間并呈白霧狀,無蟲害,無蟲咬).

無水檸檬酸、乳酸鈣、氯化鈣、海藻酸鈉、β-環狀糊精、果膠、羧甲基纖維素鈉(河南萬邦實業有限公司),黃原膠(河南明瑞食品添加劑有限公司),以上試劑均為食品級.

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外-可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;BCD-190TMPK冰箱,海爾智家股份有限公司;FA1104型電子天平,上海良平儀器儀表有限公司;2200TH數控超聲清洗器,上海安譜實驗科技股份有限公司;SHZ-DⅢ循環水式真空泵,鞏義市予華儀器有限公司;DZKW-12-2電熱恒溫水浴鍋,北京市永光明醫療儀器有限公司;80-2電動離心機,常州市江南實驗儀器廠;1.0 mL注射器,上海凱樂輸液器廠.

1.3 方法

1.3.1 藍莓花青素粗提原液提取 準確稱取10.00 g于-18 ℃速凍3 h后的藍莓鮮果,40 kHz、20 ℃、10 min進行超聲波解凍[12],解凍后研磨,按1∶10料液比加入15%檸檬酸,50 ℃恒溫水浴浸提1 h后,4 000 r/min離心10 min得上層清液,即為藍莓花青素粗提原液.

1.3.2 藍莓花青素微膠囊制備 取10.0 mL藍莓花青素粗提原液與一定濃度乳酸鈣溶液,按體積比1∶7配制成芯材溶液.用1.0 mL注射器吸取一定比例混合壁材溶液滴入一定濃度芯材溶液,按一定超聲輔助條件進行包埋[13],參考文獻[14]方法略作修改后計算包埋率:

(1)

式(1)中,W為藍莓花青素微膠囊的包埋率,A1為原液稀釋10倍的吸光度值,A2為包埋后樣液稀釋10倍的吸光度值.

1.3.3 藍莓花青素微膠囊制備條件優化

(1)單因素實驗.選擇花青素粗提原液濃度、乳酸鈣濃度、乳酸鈣體積、花青素粗提原液體積、壁材濃度、壁材體積、超聲溫度、超聲時間和超聲功率9個因素進行單因素實驗.各單因素變量分別為花青素粗提原液濃度(20%、40%、60%、80%、100%的花青素粗提原液),乳酸鈣濃度(3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%),花青素粗提原液體積(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL),花青素體積(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL),壁材濃度(0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%),壁材體積(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL),超聲溫度(20、25、30、35、40 ℃),超聲時間(5、10、15、20、25、30、35 min)和超聲功率(40、50、60、70、80 kHz).

(2)正交實驗.按單因素所得最佳條件,選擇花青素粗提原液體積A、 花青素粗提原液濃度B、乳酸鈣體積C、乳酸鈣濃度D 4個因素,以包埋率為評價指標,設計L9(34)正交實驗.

(3)響應面設計實驗.按單因素所得最佳條件,選擇花青素粗提原液體積A、花青素粗提原液濃度B、乳酸鈣體積C、乳酸鈣濃度D為考察因素,以包埋率為響應值,采用響應面法優化藍莓花青素微膠囊制備工藝.

2 結果與分析

2.1 藍莓花青素粗提原液濃度的確定

由圖1可知,花青素粗提原液濃度會影響包埋效果.混合壁材海藻酸鈉+β-環狀糊精、海藻酸鈉+果膠對不同濃度花青素粗提原液包埋效果要好于混合壁材海藻酸鈉+黃原膠、海藻酸鈉+羧甲基纖維素鈉和單一海藻酸鈉壁材,且后兩種混合壁材包埋率較單一壁材包埋率低.相比其他混合壁材,海藻酸鈉+β-環狀糊精更為優越.當20%花青素粗提原液作芯材時,混合壁材海藻酸鈉+β-環狀糊精和單一壁材海藻酸鈉的包埋率分別為 84.93%、81.86%;當40%花青素粗提原液作芯材時,混合壁材海藻酸鈉+果膠的包埋率較其他濃度的花青素粗提原液要高,達81.89%.因此,在進行包埋比較時,采用海藻酸鈉、海藻酸鈉+β-環狀糊精作壁材時,選擇20%花青素粗提原液作芯材;采用海藻酸鈉+果膠作壁材時,選擇40%花青素粗提原液作芯材.

圖1 藍莓花青素粗提原液濃度的確定

2.2 乳酸鈣濃度的確定

由圖2可知,包埋率隨乳酸鈣濃度增加而提高,乳酸鈣濃度5.0%時包埋率較其他濃度時要高,海藻酸鈉、海藻酸鈉+β-環狀糊精、海藻酸鈉+果膠作為壁材時包埋率依次為85.97%、86.70%、86.34%;之后,花青素包埋率隨乳酸鈣濃度增加開始下降,由于乳酸鈣與海藻酸鈉反應生成海藻酸鈣膜包裹住花青素,乳酸鈣濃度過高或過低,都會使Ca2+選擇性取代海藻酸鈉中Na+,導致微膠囊內部分布不均勻,使包埋率下降[15].因此,選擇5.0%乳酸鈣進行包埋.

圖2 乳酸鈣濃度的確定

2.3 乳酸鈣體積的確定

由圖3可知,包埋率隨著乳酸鈣用量的增加而提高,但乳酸鈣用量過大會導致微膠囊硬度變小,可能由于乳酸鈣用量越大整個體系酸性越強而導致花青素受到破壞.海藻酸鈉、海藻酸鈉+β-環狀糊精、海藻酸鈉+果膠3種壁材的乳酸鈣用量在8.0 mL時,包埋率高,包埋效果好,包埋率分別為82.73%、80.91%、78.34%.因此,選擇乳酸鈣用量8.0 mL進行包埋.

圖3 乳酸鈣體積的確定

2.4 花青素粗提原液體積的確定

由圖4可知,20%花青素粗提原液作芯材、海藻酸鈉和海藻酸鈉+β-環狀糊精作壁材時,花青素用量越少包埋率越高,依次為85.90%、82.72%;40%花青素粗提原液作芯材、海藻酸鈉+果膠作壁材時,花青素用量越少包埋率越高,為87.80%.不管用哪個條件的壁材還是芯材,包埋后的微膠囊顏色都較淺,只有花青素體積為2.0 mL時,包埋顏色深、硬度大且包埋率大.因此,選擇2.0 mL花青素粗提原液進行包埋.

圖4 花青素粗提原液體積的確定

2.5 壁材濃度的確定

由圖5可知,0.8%、0.9%海藻酸鈉作壁材時,包埋率分別為81.44%、80.66%,包埋效果沒有明顯區別.海藻酸鈉+β-環狀糊精作壁材在濃度0.9%時包埋率達83.46%,海藻酸鈉+果膠作壁材在濃度0.8%時包埋率達84.45%,可見,海藻酸鈉+果膠混合壁材比單一海藻酸鈉、海藻酸鈉+β-環狀糊精混合壁材包埋效果要好.當海藻酸鈉濃度超過0.8%時,包埋率顯著下降,可能是因為濃度過大導致溶液黏度過大,流變特性變差,這一結果與文獻[16]中制備的微膠囊海藻酸鈉濃度影響規律基本一致,因此,選擇0.8%海藻酸鈉+果膠作為壁材進行包埋.

圖5 壁材濃度的確定

2.6 壁材體積的確定

由圖6可知,當混合壁材體積固定在5.0 mL時,隨著海藻酸鈉體積增加,包埋率先增加后降低.當海藻酸鈉體積在4.0 mL時,果膠復合壁材包埋率高于β-環狀糊精復合壁材,此時包埋率為81.12%,因此,以下實驗均選擇海藻酸鈉+果膠作為壁材進行包埋.

圖6 壁材體積的確定

2.7 超聲溫度的確定

由圖7可知,隨著超聲溫度的升高,包埋率變化有所不同.超聲溫度在25 ℃時,包埋率比20 ℃和30 ℃要高,但仍沒有35 ℃時高.超聲溫度在35 ℃時,包埋率達80.14%,因此,選擇超聲溫度35 ℃進行包埋.

圖7 超聲溫度的確定

2.8 超聲時間的確定

由圖8可知,當超聲時間增加時,微膠囊的包埋率先增加后降低,在超聲波輔助包埋條件下,芯材進入壁材中形成空腔,使芯材被包埋.由于包埋反應放熱,當超聲波輔助包埋時間增加時,超聲波熱效應能引起體系溫度升高,在一定程度上會使包埋反應向反方向進行,進而影響微膠囊的包埋率.當超聲時間為30 min時,包埋率為83.92%,因此,選擇超聲時間30 min進行包埋.

圖8 超聲時間的確定

2.9 超聲功率的確定

由圖9可知,當超聲功率增加時,微膠囊包埋率普遍較低,可能是超聲功率較高使機械剪切力太強破壞了芯材體系,導致包埋率較低,這與文獻[17]轉速對雙包埋原花青素微膠囊化效果的影響一致.在超聲功率40 kHz時,包埋率最高為82.56%,因此,選擇超聲功率40 kHz進行包埋.

圖9 超聲功率的確定

2.10 正交實驗結果

根據單因素實驗結果,固定壁材濃度0.8%、壁材體積4.0 mL、超聲溫度35 ℃、超聲時間30 min、超聲功率40 kHz,選擇A(花青素粗提原液體積,1.0、2.0、3.0 mL)、B(花青素粗提原液濃度,20%、40%、60%)、C(乳酸鈣體積,7.0、8.0、9.0 mL)、D(乳酸鈣濃度,4.0%、5.0%、6.0%)4個因素,以包埋率為評價指標,設計L9(34)正交實驗,因素水平見表1,實驗結果見表2、表3.

表1 因素水平表

表2 正交實驗結果

表3 方差分析

由表2可知,各因素對微膠囊包埋率影響的順序為A>B>C>D,極差分析可知最佳工藝條件為A1B2C1D3,即花青素粗提原液體積1.0 mL、花青素粗提原液濃度40%、乳酸鈣體積7.0 mL、乳酸鈣濃度6.0%.

由表3可知,因素A對包埋率有顯著影響,因素B、因素C、因素D對包埋率沒有影響.按各因素F值大小順序排列:A>B>C>D,與直觀分析結果一致.

2.11 驗證實驗結果

將正交表里包埋率最高的組合、正交直觀分析最優組合、單因素最佳組合(A1B2C2D2、A1B2C1D3、A2B2C2D2)進行驗證實驗,包埋率分別為92.52%、84.57%、81.54%.雖然前一個組合包埋率較高,但是微膠囊顏色較淺,而正交直觀分析最優組合與單因素最佳組合包埋顏色接近,因此,最終采用正交直觀分析最優組合進行包埋.

2.12 響應面二次回歸正交旋轉實驗結果

因素E壁材濃度、F壁材體積、G超聲溫度、H超聲時間、I超聲功率經單因素多次重復實驗驗證,無顯著性差異,因此,以下實驗選擇A花青素粗提原液體積、B花青素粗提原液濃度、C乳酸鈣體積、D乳酸鈣濃度,以包埋率(y)為評價指標,設計L36(54)響應面二次回歸正交旋轉實驗,因素編碼見表4,實驗結果見表5、表6、表7.

表4 因素編碼

表5 二次回歸正交旋轉實驗結果

表6 方差分析

表7 簡化后回歸方程的方差分析表

由表6可知,采用二次回歸正交旋轉組合設計進行實驗,得到初步擬合回歸方程

y=81.886-5.632x1+0.195x2+0.273x3+0.798x4-0.749x1x2+0.251x1x3+0.401x1x4+

回歸方程關系顯著,證明實驗結果有效,但只有x1因素達到顯著水平,其余因素均不顯著.二次正交旋轉組合設計的回歸方程雖然有意義,但失擬效果極顯著,所以擬合度不好,因此,剔除不顯著因素重新進行二次顯著性檢驗,見表7.

由表7可知,剔除不顯著因素后,x1的回歸系數極顯著,回歸方程極顯著,擬合度極顯著.雖然剔除不顯著因素后方程的擬合度有明顯改善,但是擬合度仍較差,因此,只用此模型預測最佳包埋條件.剔除不顯著因素后的回歸方程為y=81.886-5.632x1,預測藍莓花青素體積在1.0～2.0 mL時包埋率較高,與單因素實驗、正交實驗所得最佳花青素粗提原液體積完全一致.

3 結論

銳孔法制備藍莓花青素微膠囊,避免了外界條件對花青素的破壞,提高了藍莓花青素的穩定性.以包埋率為評價指標,通過單因素實驗和正交實驗優化銳孔法制備藍莓花青素微膠囊制備最佳工藝為:以1.0 mL 40%花青素粗提原液與7.0 mL 6.0%乳酸鈣為芯材、4.0 mL 0.8%海藻酸鈉+果膠為壁材,在超聲功率40 kHz、超聲溫度35 ℃、超聲時間30 min條件下制備微膠囊,包埋率達84.57%,球狀效果好,顏色鮮艷.通過四因素二次回歸正交旋轉組合設計進行實驗,得到回歸方程y=81.886-5.632x1,預測藍莓花青素粗提原液體積在1.0～2.0 mL時包埋率較高.研究發現,超聲波輔助能夠促進和提高藍莓花青素的包埋率,但影響并不顯著;混合壁材與單一壁材包埋比較,包埋率提高并不明顯;將花青素粗提原液與乳酸鈣組成混合芯材溶液,比先加芯材溶液后加入乳酸鈣包埋效果好.以后的研究中將對純化后的藍莓花青素溶液進行微膠囊化處理,以期得到更高的包埋率,提高藍莓花青素的穩定性,為藍莓花青素的開發應用提供一定的技術支持.