海藻有機肥對茉莉花產量、品質的影響及分子機制*

陳云喜,藍雪雯,陳寶如,陸新范,崔學宇@

(1.南寧師范大學 北部灣環境演變與資源利用教育部重點實驗室;廣西地標作物大數據工程技術研究中心;廣西地表過程與智能模擬重點實驗室,廣西 南寧 530100;2.廣西華米現代農業發展有限公司,廣西 南寧 530001)

茉莉花[Jasminumsambac(L.)Aiton]是一種具有重要經濟價值的常綠矮灌木[1],在我國主要種植于廣西、福建、四川等省(區)[2]。如何提高茉莉花的產量和品質是茉莉花研究的核心問題,合理的施肥是解決這一問題的重要手段[3-4]。海藻生物肥料包含大量的植物所需營養元素及有效活性成分,在多種植物中的栽培中用于品質和產量的改良[5-6]。在草莓和火龍果中的研究中表明,合理的利用海藻生物肥對果實營養成分的含量和產量有顯著的促進作用[7-8]。在甜櫻桃中的研究表明,海藻提取液可以改良甜櫻桃的生長狀態以及改善果實的品質[5]。在煙草中的研究表明,海藻肥在提高煙草品質的同時對煙草青枯病的防御有積極的效果[9]。在番茄中的研究中發現,海藻肥的噴施可以增加番茄的鮮重,促進光合,同時可以提高番茄的營養成分[10]。此外,海藻肥料對植物非生物脅迫的抗性的提高有積極的影響[11-13]。海藻肥的施用效果已在多種植物進行了研究,但是否影響茉莉花的產量和品質尚未見報道。這里探討的是海藻肥對茉莉花生長和產量的影響,同時利用GC-MS的方法對茉莉花揮發性有機物進行了測定,還進行了轉錄組測序,用以明確海藻肥對茉莉花產量、品質的影響及其可能的分子機制,為海藻肥在茉莉花栽培的田間應用提供理論及實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用茉莉花品種為橫州市主栽品種雙瓣茉莉花,茉莉花種植年限為3年,長勢均勻,栽培土壤是赤紅壤。試驗所需海藻肥廣州埃瑞卡生物科技有限公司提供。

在茉莉花剪枝后進行第一次施肥處理,15日后進行第2次施肥處理(2021年6月3日第一次處理),7月3日進行試驗數據采集和田間取樣。試驗設置3個處理,分別為對照、海藻肥、高磷復合海藻肥,處理小區行長11m,行寬1m,每個處理3次重復。

葉綠素測定儀為山東普創儀器有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 生理指標測定

葉片厚度測量(10片):選取10片形態大小相似的茉莉花成熟葉片,利用游標卡尺測量10片葉片的整體厚度,每個處理3次重復。

葉綠素含量測定:選取形態大小相似的茉莉花成熟葉片,利用手持葉綠素測定儀進行葉綠素含量測定,每個處理3次重復。

花枝重量測定(10枝):花芽下剪取5 cm花枝,10枝總重為一組,稱取重量,每個處理3次重復。

花枝莖粗測定:花芽下剪取5 cm花枝,利用游標卡尺測定其莖粗,每個處理3次重復。

百蕾鮮重測定:測定百蕾鮮重(含苞待放、花筒伸長、外觀飽滿),每個處理3次重復。

總產量測定:每個處理選擇2 m2的小區,對花蕾進行采摘,連續采摘2日,計算總產量,每個處理3次重復。

1.2.2 轉錄組測序/揮發性代謝物測試

表1 實時定量 PCR 引物序列

采集將要開放的新鮮花蕾和葉片,液氮速凍,干冰郵寄至武漢邁特維爾生物科技有限公司完成測試。

1.2.3 實時定量PCR測試

結合田間生理數據和轉錄組表達結果,挑選9個光合相關基因設計引物,在葉片中進行實時定量PCR分析,分析選取Actin基因作為內參,測試委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 海藻肥處理對茉莉花生理指標的影響

不同處理對茉莉花的生理指標影響見表2。葉片厚、花枝重和產量這3個性狀,均為高磷海藻肥處理>海藻肥處理>對照;兩種施肥處理均提高了茉莉花的百蕾重,但兩種施肥處理之間沒有顯著差異;葉綠素含量和花枝粗則表現為高磷海藻肥處理最高,海藻肥處理和對照沒有顯著差異。

表2 海藻肥處理對茉莉花生理指標的影響

2.2 海藻肥處理對茉莉花揮發性代謝物的影響

利用GC-MS的方法在茉莉花中分離到14大類108種揮發性代謝物,包括19種萜類、17種酯、15種雜環類化合物、13種烴類、9種酮、9種醇、7種芳烴、5種鹵代烴、5種醛、3種含硫化合物、2種酸、2種含氮化合物、1種酚和1種胺。代謝物及樣本均聚類結果如圖1所示。由圖1看出,相同處理的組別被聚類到同一組中。

利用Fold Change、OPLS-DA模型的VIP值相結合的方法對不同處理的茉莉花差異代謝物進行篩選,結果見表3。由表可知,與對照相比,施肥處理后均有部分代謝物顯著下調。其中海藻肥和對照處理相比,顯著下調的揮發性代謝物有6種,包括4種酯、1種酸和1種芳烴,這6種揮發性代謝物分別為:十八烯酸甲酯(Methyl stearate)、3-甲基-6-苯基-4-(1-苯基乙氧基)-1-己烯(3-methyl-6-phenyl-4-(1-phenylethoxy)-1-Hexene)、(Z)-十六烷基十一烯基乙酸酯(11-Hexadecen-1-ol,acetate,(Z)-)、十六酸甲酯(Hexadecanoic acid,methyl ester)、十七烷酸(Heptadecanoic Acid)和2-糠酸己酯(2-Furancarboxylic acid,hexyl ester);高磷海藻肥和對照相比,顯著下調的揮發性代謝物是十八烯酸甲酯;高磷海藻肥和海藻肥處理相比,顯著上調的揮發性代謝物有4種,包括2種酸和2種酯,這6種揮發性代謝物分別為(Z)-十六烷基十一烯基乙酸酯、十六酸甲酯、十七烷酸和(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二酸(2,6-Octadienoic Acid,3,7-dimethyl-,(E)-)。

表3 差異代謝物數量統計

2.3 不同處理茉莉花葉片轉錄組的差異分析

測序過濾后得到63.32G的clean data,組裝獲得93173條基因,基因的平均長度為1140 bp,利用主成分分析對不同處理后茉莉花的變量內部結構進行分析,PCA結果如圖2所示。由圖可知,相同處理的茉莉花相對聚集。

圖2 PCA 圖

對不同組間差異基因進行篩選,差異基因的篩選條件為 |log2Fold Change|>=1,且符合用Benjamini-Hochberg方法對假設檢驗概率(P value)進行多重假設檢驗校正后錯誤發現率(FDR)<0.05。對差異基因的統計見表4,不同組別之間差異基因的重疊情況如圖3所示。

圖3 差異表達基因的維恩圖

圖4 差異基因 KEGG 富集分析(對照和海藻肥處理)

圖5 差異基因 KEGG 富集分析(對照和高磷海藻肥處理) 圖6 差異基因 KEGG 富集分析(高磷海藻肥和海藻肥處理)

圖7 光合相關基因的表達分析

表4 差異表達基因數量統計

對差異基因進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注釋,合計128個代謝通路被注釋,注釋后對其進行顯著性富集分析,富集最顯著的20條pathway如圖所示,對照和海藻肥處理、高磷海藻肥相比,有10條顯著富集的代謝通路相同,主要包括:色氨酸代謝(Tryptophan metabolism)、植物中的MAPK信號途徑(MAPK signaling pathway-plant)、丁酸代謝(Butanoate metabolism)、脂肪酸降解(Fatty acid degradation)、α-亞麻酸代謝(alpha-Linolenic acid metabolism)、酮體的合成與降解(Synthesis and degradation of ketone bodies)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)、甘油磷脂代謝(Glycerophospholipid metabolism)、單環菌素生物合成(monobactam biosynthesis)等;高磷海藻肥和對照、海藻肥處理相比,有7條顯著富集的代謝通路相同,主要包括:磷酸戊糖途徑/糖醛酸途徑(Pentose and glucuronate interconversions)、光合作用(Photosynthesis)、吲哚生物堿生物合成(Indole alkaloid biosynthesis)、半乳糖代謝(Galactose metabolism)、RNA聚合酶(RNA polymerase)。

2.4 海藻肥處理對光合作用相關基因的影響

對轉錄組結果進行分析發現,海藻肥和對照相比,捕光復合體Ⅱ葉綠素 a/b 結合蛋白基因Lhca1、Lhcb1基因表達下降,Lhca4、Lhca2基因表達上升,光系統相關基因Psa L基因表達上升。高磷海藻肥和對照相比,提高了捕光復合體Ⅱ葉綠素 a/b 結合蛋白基因Lhca1、Lhca4、Lhcb6基因的表達,同時提高了光系統相關基因Psb Q、Psa E、Psa N、Psa L基因的表達;高磷海藻肥和海藻肥處理相比提高了捕光復合體Ⅱ葉綠素 a/b 結合蛋白基因Lhca1、Lhca4、Lhcb1、Lhcb4、Lhcb6的表達,同時提高了光系統相關基因Psb Q、Psa E、Psa F、Psa G、Psa L基因的表達,對相關基因進行實時定量PCR驗證,驗證結果表明和轉錄組測序結果趨勢一致,轉錄組結果真實可靠,證明施肥處理后對光合相關基因表達有促進的作用。

3 討 論

隨著技術的發展,檢測代謝物已是驗證作物品質差異的有效方法[14-15]。前人對廣西橫縣11個樣點茉莉花揮發組分的GC-MS檢測到242個已知的香氣組分,本研究在不同海藻肥處理的茉莉花樣本中分離到14大類108種揮發性代謝物,將這些組分和前人的11個樣點中香氣組分含量前50的化合物相比,有15個化合物在本研究中檢測出來,產生結果差異可能是數據庫之間的差異。香氣是茉莉花品質的重要評判指標[16-17],花香在茉莉花生長的過程中容易受到外界因素的影響[18-19]。前人利用HS-SPME/GC-MS的方法在32個茉莉花鮮花樣本中獲得了29種特征性揮發物,這些揮發性化合物占茉莉花茶揮發物含量的95%以上[20]。在本研究中2個施肥處理組和對照相比,十八烯酸甲酯的含量均下降,此外有5種揮發性物質在僅施海藻肥組和對照組之間含量有差異,但是這些差異物質沒有包含在前人研究的茉莉花特征揮發物質之中,說明海藻肥處理后,由于產量的提高,茉莉花品質可能發生了有限度的下降,磷肥對這種品質的下降有一定的補償作用。

本研究發現,海藻肥和高磷海藻肥處理后,增加了茉莉花的葉片厚度、花枝重量、花枝莖粗、百蕾鮮重,提高了茉莉花的葉綠素含量和茉莉花的產量。在茉莉花平衡施肥的研究中表明,茉莉花的產量和磷肥施用成正相關,合理施肥是茉莉花高產優質的關鍵因素。本研究中,海藻肥施用可以提高茉莉花的產量,在海藻肥施用的基礎上增加磷肥的施用可以更高的提高茉莉花的產量,磷肥的施用可能是茉莉花高產的關鍵因子之一。隨著技術的發展,高通量測序技術可以揭示作物產量、品質變化的分子機制[21-24]。本研究中,不同組別之間合計128個代謝通路被富集,對顯著富集的代謝通路進行分析發現,大多數顯著富集的代謝通路與物質代謝相關,高磷海藻肥和對照、海藻肥處理相比,光合作用這一代謝通路均被顯著富集。前人在茶用菊中的研究表明,光合速率和葉綠素含量和產量極顯著正相關[25],本研究同樣證明施肥處理后,茉莉花產量的提高可能是施肥處理可以提高茉莉花葉綠素的含量,同時提高了光合相關基因的表達。

4 結論

利用田間測試、GC-MS和轉錄組測序的手段對海藻肥、高磷海藻肥處理后茉莉花產量品質的變化進行了研究,結果表明,高磷海藻肥處理后,增加了茉莉花的葉片厚度、花枝重量、花枝莖粗、百蕾鮮重,提高了茉莉花的葉綠素含量和產量;施肥處理后,部分揮發性代謝物表達下調,磷的施用可以減少下調代謝物的數量;施肥處理促進了葉片光合相關基因的表達可能是茉莉花產量提高的原因。