黃芩苷對多囊卵巢綜合征大鼠顆粒細胞增殖和凋亡的影響

范宏芳,王孜涵,王 莉,馬韻翼,鈕紅麗,翟俊英,姜李樂

1.河南大學附屬南陽市第一人民醫院生殖醫學科，南陽 473000；2.河南省人民醫院生殖醫學科，鄭州 450000

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種常見的內分泌紊亂和代謝異常的婦科疾病，其主要臨床表現為持續性無排卵、卵巢多囊樣改變、高雄激素血癥以及胰島素抵抗［1］，多數學者認為卵泡內顆粒細胞凋亡可能是其發病的主要原因［2］。研究發現，黃芩苷聯合二甲雙胍治療PCOS 大鼠可改善其內分泌紊亂，抑制炎癥反應，改善胰島素抵抗和子宮內膜損傷［3］。另有學者研究發現，黃芩苷聯合二甲雙胍可逆轉PCOS 大鼠卵巢多囊性改變，其機制可能與抑制卵巢顆粒細胞凋亡相關［4］。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路與細胞增殖、分化和凋亡密切相關。研究表明，隱丹參酮通過激活PI3K 途徑可改善PCOS 大鼠生殖機能異常［5］?；谝陨涎芯?，本實驗通過建立PCOS 大鼠模型，探討黃芩苷對卵巢顆粒細胞增殖和凋亡的影響及對PI3K/Akt 信號通路的調節作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

酶標儀（美國Bio-Rad 公司）；流式細胞儀（美國BD 公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）；低溫高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 試藥

黃芩苷（質量分數≥98%，批號B20570，上海源葉生物科技有限公司）；脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA，武漢華美科技集團有限公司）；炔雌醇環丙孕酮片（達英-35），拜耳醫藥保健有限公司）；黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、睪酮（testosterone，T）、雌二醇（estradiol，E2）試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、磷酸化磷脂肌醇3-激酶（phospho PI3K，p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化蛋白激酶B（phospho Akt，p-Akt）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）抗體均購自美國Abcam 公司。

1.3 動物

健康清潔級雌性SD 大鼠60 只，8 周齡，體質量為180～200 g，購自北京天誠醫藥科技有限公司，許可證號為SYXK（京）2016-0047。

2 方法

2.1 造模與分組

PCOS 大鼠模型的制備：隨機選取48 只大鼠，按照0.6 g·kg-1的劑量將DHEA 經頸背部皮下注射入大鼠體內，每日1 次，連續20 d，光學顯微鏡下觀察大鼠陰道涂片，若陰道上皮細胞持續角化，動情周期消失即視為模型制備成功［6］。將造模成功的48 只大鼠隨機分為模型組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對照組，每組12 只。黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組大鼠分別灌胃25、50 mg·kg-1黃芩苷，陽性對照組大鼠灌胃0.339 2 mg·kg-1達英-35，對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，每日1 次，連續3 周。

2.2 酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

藥物干預結束后第2 天，尾靜脈采血2 mL，以3 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8 cm），根據ELISA 試劑盒說明書將對照品稀釋至所需質量濃度，酶標板設置空白孔、對照品孔和待測樣品孔，將稀釋后的對照品50 μL 置于對照品孔中，待測樣品孔中加入稀釋液40 μL，再加入待測樣品10 μL，37 ℃孵育30 min，洗滌液洗滌5 次，拍板，甩干，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標記的鏈霉親和素50 μL，再加入四甲基聯苯胺50 μL，反應15 min，置于酶標儀上，在490 nm 波長處測定吸光度（A）值。

2.3 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色

采血完成后，頸椎脫臼法處死大鼠，取出左側卵巢組織，置于4 g·L-1多聚甲醛中固定，脫水、包埋、切片后，用蘇木素和伊紅染液染色，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察大鼠卵巢組織病理學變化。

2.4 顆粒細胞分離

取大鼠右側卵巢組織，生理鹽水沖洗3 次，去除多余脂肪組織，解剖鏡下用無菌注射器針頭刺破卵巢上的卵泡，釋放顆粒細胞，用生理鹽水沖洗，200 目篩過濾，以1 500 r·min-1離心5 min，棄上清液，用生理鹽水將沉渣重懸，再次離心，上層細胞即為顆粒細胞［7］。

2.5 細胞增殖檢測試劑盒（cell Counting Kit-8，CCK-8）

調整細胞密度為106個·mL-1，接種于96 孔板中，加入200 μL 含10 g·L-1胎牛血清的培養基中培養48 h，取出培養板，每孔加入20 μL CCK-8 溶液，培養箱中繼續培養4 h，用酶標儀在450 nm 波長處測定A值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組A值/對照組A值）×100%。

2.6 流式細胞儀法

調整細胞密度為106個·mL-1，接種于96 孔板中，加入200 μL 含培養基培養48 h，離心收集細胞，加入結合緩沖液500 μL 將細胞重懸，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）和膜聯蛋白V（Annexin V）各5 μL，充分混勻，避光反應15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.7 蛋白印跡法

收集顆粒細胞，加入放射免疫沉淀法緩沖液（radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA）裂解細胞，在4 ℃條件下以12 000 r min-1離心10 min，收集上清液，二奎啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測定蛋白質量濃度，調整蛋白質量濃度。加蛋白樣品，120 V 恒壓進行凝膠電泳，0.3 A 恒流進行濕轉，洗膜，脫脂奶粉室溫封閉，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜，二抗室溫孵育1 h，洗膜，增強型化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑法顯色，Image J 分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參灰度值。

2.8 統計學方法

用SPSS21.0 統計學軟件分析數據，計量資料均以（±s）表示，多樣本計量資料比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 血清激素含量測定結果

FSH、E2、LH 和T 含量組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組FSH、E2含量降低，LH、T 含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對照組FSH 和E2 含量升高，LH 和T 含量降低（P＜0.05）；與黃芩苷低劑量組比較，黃芩苷高劑量組和陽性對照組FSH、E2 含量升高，LH、T 含量降低（P＜0.05）；與黃芩苷高劑量組比較，陽性對照組FSH、E2 含量升高，LH、T 含量降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清激素含量的比較 （n=12, ±s）Tab.1 Comparison of serum hormone content in each group （n=12,±s）

表1 各組大鼠血清激素含量的比較 （n=12, ±s）Tab.1 Comparison of serum hormone content in each group （n=12,±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃芩苷低劑量組比較，cP＜0.05；與黃芩苷高劑量組比較，dP＜0.05。

項目對照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷高劑量組陽性對照組FP FSH/（U·L-1）6.09±1.07 2.09±0.82a 3.15±0.81ab 4.22±0.97abc 5.15±0.77abcd 35.833＜0.001 E2/（pmol·L-1）130.71±7.42 36.06±5.01a 55.00±5.98ab 73.77±7.26abc 102.39±12.16abcd 267.404＜0.001 LH/（U·L-1）3.44±0.45 14.94±1.64a 10.63±1.47ab 8.07±0.88abc 5.43±1.01abcd 171.950＜0.001 T/（nmol·L-1）21.70±4.45 147.21±10.20a 118.30±9.18ab 84.23±8.20abc 49.33±8.82abcd 423.011＜0.001

3.2 HE 染色結果

對照組大鼠可見黃體，未見囊狀擴張卵泡；模型組大鼠卵巢體積增大，少見黃體，可見囊狀擴張卵泡；黃芩苷低劑量組和高劑量組以及陽性對照組大鼠卵巢體積減小，可見黃體，囊狀卵泡擴增不明顯。見圖1。

圖1 HE 染色觀察卵巢組織的病理變化（×200）Fig.1 The pathological changes of ovarian tissue observed by HE staining (×200)

3.3 CCK-8 法檢測結果

細胞存活率組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組細胞存活率降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對照組細胞存活率升高（P＜0.05）；與黃芩苷低劑量組比較，黃芩苷高劑量組和陽性對照組細胞存活率升高（P＜0.05）；與黃芩苷高劑量組比較，陽性對照組細胞存活率升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠卵巢顆粒細胞存活率的比較（n=12, ±s）Tab.2 Comparison of the survival rate of ovarian granulosa cells in each group (n=12,±s)

表2 各組大鼠卵巢顆粒細胞存活率的比較（n=12, ±s）Tab.2 Comparison of the survival rate of ovarian granulosa cells in each group (n=12,±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃芩苷低劑量組比較，cP＜0.05；與黃芩苷高劑量組比較，dP＜0.05。

項目對照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷高劑量組陽性對照組FP細胞存活率100.00%59.33%±5.35%a 69.08%±8.63%ab 82.04%±4.30%abc 93.16%±2.86%abcd 128.688＜0.001

3.4 流式細胞儀檢測結果

細胞凋亡率組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對照組細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與黃芩苷低劑量組比較，黃芩苷高劑量組和陽性對照組細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與黃芩苷高劑量組比較，陽性對照組細胞凋亡率降低（P＜0.05）。見表3、圖2。

圖2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率Fig.2 The apoptosis rate measured by flow cytometry

表3 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率的比較 （n=12，±s）Tab.3 Comparison of apoptosis rate of ovarian granulosa cells of rats in each group (n=12，±s)

表3 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率的比較 （n=12，±s）Tab.3 Comparison of apoptosis rate of ovarian granulosa cells of rats in each group (n=12，±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃芩苷低劑量組比較，cP＜0.05；與黃芩苷高劑量組比較，dP＜0.05。

項目對照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷高劑量組陽性對照組FP細胞凋亡率2.36%±0.66%9.18%±0.84%a 8.17%±0.82%ab 6.99%±0.77%abc 4.49%±0.92%abcd 138.887＜0.001

3.5 蛋白印跡法檢測結果

p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對表達量組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對照組p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與黃芩苷低劑量組比較，黃芩苷高劑量組和陽性對照組p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與黃芩苷高劑量組比較，陽性對照組p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。PI3K 和p-Akt 蛋白相對表達量組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4、圖3。

圖3 蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoretic map of protein expression

表4 各組大鼠卵巢組織中蛋白相對表達量的比較 （n=12, ±s）Tab.4 Comparison of relative protein expression levels in ovarian tissues of rats in each group (n=12,±s)

表4 各組大鼠卵巢組織中蛋白相對表達量的比較 （n=12, ±s）Tab.4 Comparison of relative protein expression levels in ovarian tissues of rats in each group (n=12,±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃芩苷低劑量組比較，cP＜0.05；與黃芩苷高劑量組比較，dP＜0.05。

項目對照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷高劑量組陽性對照組FP p-PI3K 0.98±0.04 0.11±0.02a 0.35±0.05ab 0.64±0.06abc 0.89±0.03abcd 877.820＜0.001 PI3K 0.99±0.03 0.98±0.04 0.95±0.05 0.99±0.03 0.95±0.06 2.372 0.065 p-Akt 0.98±0.06 0.10±0.02a 0.42±0.06ab 0.73±0.06abc 0.86±0.05abcd 549.872＜0.001 Akt 0.97±0.05 0.94±0.03 0.94±0.06 0.98±0.03 0.95±0.06 1.566 0.198

4 討論

卵泡的生長發育是一個精細而復雜的過程，而卵巢顆粒細胞在其中發揮重要作用，在竇前卵泡后期，顆粒細胞出現FSH 受體，FSH 誘導顆粒細胞芳香化酶合成，而芳香化酶可使顆粒細胞將睪酮轉化成雌激素，竇卵泡期FSH 受體大量合成，產生大量雌激素，從而促進卵泡發育，形成優勢卵泡，但顆粒細胞凋亡可阻止睪酮轉變為雌激素，導致雄激素累積，發生高雄激素血癥［8］。雄激素的大量積累造成卵泡發育阻滯，優勢卵泡的選擇出現障礙，大量小竇狀卵泡積聚，卵巢發生多囊狀改變［9］。由此可見，顆粒細胞凋亡可能是發生PCOS 的重要機制。且SHEN H R 等［10］研究發現，PCOS 大鼠顆粒細胞凋亡率升高，用黃連素處理后可降低細胞凋亡率、抑制炎癥反應、改善激素代謝異常。但是顆粒細胞凋亡的具體機制仍待進一步研究。

黃芩苷是一種黃酮類化合物，已有研究表明，黃芩苷可調整PCOS 大鼠激素代謝異常，改善卵巢組織病理學改變和卵泡發育，同時降低炎癥反應［11］。黃芩苷在抑制細胞凋亡方面的作用已有很多研究，YU H 等［12］研究發現黃芩苷可通過激活Nrf2/HO-1信號軸有效抑制缺氧誘導的H9C2 細胞凋亡。黃芩苷還可減輕三氧化二砷誘導的人臍靜脈內皮細胞氧化損傷和細胞凋亡［13］。本研究HE 染色結果顯示，對照組大鼠可見黃體，未見囊狀擴張卵泡；模型組大鼠卵巢體積變大，少見黃體，可見囊狀擴張卵泡；黃芩苷低劑量組、高劑量組及陽性對照組大鼠卵巢體積變小，可見黃體，囊狀卵泡擴增不明顯。此外，通過CCK-8 法和流式細胞儀檢測黃芩苷對卵巢顆粒細胞增殖和凋亡的影響結果表明，與對照組比較，模型組顆粒細胞存活率降低，凋亡率升高；與模型組比較，黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組顆粒細胞存活率升高，凋亡率降低。結果表明，黃芩苷可抑制顆粒細胞凋亡、促進增殖。正常生理狀況下，卵泡的生長發育通過多種激素的精密調控有序進行，包括T、LH、E2 和FSH，而PCOS 患者由于激素代謝紊亂，通常表現為血清T 和LH 含量升高，而E2 和FSH 含量降低［14-15］。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清中FSH 和E2 含量降低，而T 和LH 含量升高；黃芩苷治療后與模型組比較，大鼠血清中FSH 和E2含量升高，而T 和LH 含量降低。表明黃芩苷可改善PCOS 大鼠性激素代謝異常。

PI3K/Akt 通路在細胞凋亡、細胞分化及細胞周期進程中發揮著重要作用［16-17］。XIE F 等［18］研究發現，褪黑素通過激活PI3K-Akt 通路抑制顆粒細胞自噬和凋亡，改善PCOS 大鼠卵巢功能障礙。YU J等［19］研究表明，黃連素通過激活PI3K/AKT 途徑對PCOS 的有益作用包括改變血清激素水平、恢復卵巢形態病變、改善胰島素抵抗、增強細胞活力和抑制顆粒細胞凋亡。此外，葛根素能有效降低PCOS 大鼠血糖及胰島素水平，改善胰島素抵抗，且呈濃度依賴性，其作用可能與激活PI3K/AKT/FoxO1 信號通路有關［20］。本研究結果顯示，模型組p-PI3K 和p-Akt蛋白表達水平較對照組降低，黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達水平較模型組升高。表明黃芩苷可激活PI3K/Akt 信號通路。

綜上所述，黃芩苷可改善PCOS 大鼠性激素代謝紊亂、減輕卵巢病理損傷、促進顆粒細胞增殖、抑制顆粒細胞凋亡，其可能是通過激活PI3K/Akt 信號通路發揮作用的，可為臨床治療PCOS 提供新的研究思路。