山羊基因編輯研究進展

賈宇，杜瑞麟，閆爍，張思雨，趙宇龍，高原，郭鵬飛，楊燕燕，宋永利，李喜和,4*

（1.內蒙古大學省部共建草原家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010070； 2.內蒙古大學生命科學學院蒙古高原動物遺傳資源研究中心，內蒙古 呼和浩特 010070； 3.內蒙古自治區農牧業科學院畜牧研究所，內蒙古 呼和浩特 010000； 4.內蒙古賽科星家畜種業與繁育生物技術研究院，內蒙古 呼和浩特 011517）

山羊作為人類早期馴化的家畜之一，有多種分類方式。按照體高可分為大型種、中型種及小型種，按照生產用途可分為乳用型、絨用型、毛用型、皮用型、肉用型及普通山羊[1-2]。奶山羊是公認的重要乳用品種山羊，其奶源營養價值頗高，適合飲用，是現代乳品、乳制品等的重要原料之一。絨用型山羊、毛用型山羊和皮用型山羊這3 個品種羊的絨、毛及皮產量和質量較高，被人類廣泛應用于服裝制造、材料加工等行業。肉用型山羊如波爾山羊的肉用性能較高。然而，普通山羊各個方面的生產性能都較為單一，無突出優點，常被用作科研動物模型，如研究山羊某一基因的選擇性表達等。

1 乳用型山羊基因敲除研究進展

乳脂中有98%是甘油三酯（triglyceride，TAG），其余由膽固醇和游離脂肪酸組成。TAG 中的單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）為人類提供能量，有抗心血管和抗炎作用。羊奶一直被認為是一種營養保健品，因為它的脂肪球更小，脂肪含量更高，且擁有比牛奶更低的致敏性。與牛奶相比，羊奶TAG中的中、短鏈脂肪酸（medium-chain fatty acid，MFA；short-chainfatty acid，SFA） 和不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）含量較高。

相比于牛奶，羊奶產量一直較低，而含有特定營養物質的轉基因奶山羊的乳汁產量則更為稀缺。近年來，對山羊奶奶源的研究逐漸增多。賈啟鵬等[3]通過基因編輯技術，利用成簇有規律間隔的短回文重復序列 （clustered regularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR） 及其相關蛋白 9 （CRISPR -associated 9，Cas9） 和雙載體轉染法獲得β-酪蛋白（β-casein，CSN2）基因敲除的細胞，為羊奶CSN2 基因敲除提供了核供體。該試驗首次在奶山羊胎兒成纖維細胞上實現7 760 bp 基因長片段的敲除，篩選出了奶山羊胎兒成纖維細胞敲除系最高陽性細胞比例獲得方案，從而優化了大片段陽性細胞制備技術。田慧彬[4]又利用CRISPR/Cas9 系統探究了硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1）基因在乳腺脂肪酸代謝中的功能。結果表明，SCD1 對MUFA生物合成有重要影響，同時也調控著TAG 和膽固醇的合成。該研究成果為小鼠和奶山羊SCD1 基因敲除提供了技術支持。乙酰/丙二酸單?；D移酶（acetyl-CoA and malonyl-CoA transacylases，MAT） 是脂肪酸合酶的一個功能域，反芻動物的MAT 功能域在脂肪酸合成過程中同時具有起始、延長與終止活性功能，在動物機體合成MFA、SFA 時起關鍵作用。姚瑋瑋[5]對敲除MAT 基因的乳腺上皮細胞模型進行脂代謝功能研究，發現大部分相關脂肪酸合成基因均顯著下調。microRNA（miRNA）-24 在非反芻動物的脂肪組織和肝臟的脂質代謝中起著重要作用。為明確miRNA-24 在反芻動物奶山羊中的具體作用，Huang 等[6]在原代山羊乳腺上皮細胞（goat mammary epithelial cells，GMEC） 中鑒定了miRNA-24 在調節乳汁脂肪合成和分泌過程中的功能，發現miRNA-24 能夠降低脂肪酸、TAG 和轉錄調節因子相關基因的基因豐度，miRNA-24 的敲除會抑制脂滴、TAG 和膽固醇合成并影響脂肪酸組成。該研究結果為miRNA-24 在山羊乳腺細胞脂質代謝中具有重要生物學作用提供了證據。以上研究為山羊乳腺細胞乳蛋白、乳脂合成代謝提供了重要生物學證據，并對改善羊奶脂肪酸含量奠定了基礎。

此外，奶山羊的群體性別比例對生產性能和經濟效益也有重要影響，因此通過轉基因技術進行性別控制也是科研熱點之一。Zfy 是控制哺乳動物性別的關鍵基因之一。黃敏等[7]將薩能奶山羊成纖維細胞Zfy 基因敲除進行研究，從而為奶山羊Zfy 基因的功能研究及性別控制技術的發展奠定了理論與技術基礎。

2 絨用型山羊基因敲除研究進展

絨山羊是一種以產絨為主的絨肉兼用型優良山羊品種。絨山羊的產絨性能和質量與其經濟效益密切相關，因此絨山羊的研究以其產絨性能為熱點。第一個上皮性角蛋白輔助蛋白（KAP）的發現表明，KAP 家族基因與毛囊的生長發育存在緊密關系。此外在真皮乳頭狀細胞中，同源蛋白盒（Hox）轉錄因子的表達控制著毛囊生長的區域差異。2020 年，在CRISPR/Cas9的理論基礎下，單基因編輯技術也隨之誕生。同年，李冠緯[8]利用以上技術，通過第3 代單基因編輯器（BE3）對陜北白絨山羊的成纖維細胞生長因子5 （FGF5）基因進行敲除。已知FGF5 基因是毛發生長發育的關鍵因子，其存在可抑制陜北白絨山羊絨毛的生長。當FGF5 基因被敲除后，陜北白絨山羊絨毛生長速度明顯加快，羊絨產量進一步提升。并且相關專家利用FGF5 基因在其他動物身上也開展了研究，FGF5 的錯義突變與單峰駱駝毛長變化有關[9]。膽固醇修飾的siRNA 抑制FGF5 和FGF18 的表達，可促進小鼠的毛發生長，延邊牛適應極端寒冷的氣候也與FGF5 有關。Lei 等[10]鑒定了羊毛囊形成、表皮分化和毛囊干細胞發育相關的重要基因有PRX、SOX18、TGM3 和TCF3。He 等[11]通過基因網絡分析又揭示了羊毛囊形態發育相關的關鍵基因如LAMA10、WNT25A、KRT1、SOSTDC21、ZDHHC1、FZD7、BMP4、LRP2、TGFβ79、TMEM10、SOX4、ITGB14、KRT6、ITGA2 和GLI 等。Yu等[12]研究了miR-27a 及其靶向基因PIK3R3 對AKT/MTOR 途徑以及綿羊毛囊干細胞（HFSCS）增殖和凋亡的影響，發現PIK3R3 表達的敲低可顯著抑制HFSCs的增殖并促進其凋亡，同樣，miR-27a 模擬物顯著抑制了HFSCs 的增殖并促進了細胞凋亡。

內蒙古絨山羊是中國優秀的地方品種，根據羊被毛的長度可分為3 種類型：長毛型（毛長＞22 cm）、短毛型（毛長≤13 cm）和中間型（13 cm＜毛長≤22 cm）。毛發長度也影響著羊絨經濟價值，為探究不同毛型生長的分子機制及相關調控基因，Gong 等[13]對12 月齡內蒙古長毛型（LHG）和短毛型絨山羊（SHG）的基因表達數據和表型數據進行了研究，探索了不同毛型和其相關的9 個候選基因共表達模塊。結果表明，加權基因共表達網絡分析（WGCNA）將這些基因分為19 個共表達模塊，其中1 個模塊與不同毛發類型之間存在很強的相關性。該模塊基因在LHG 中高表達，在SHG 中低表達； 對該模塊基因進行GO 功能分析，結果主要富集在細胞成分；KEGG 通路主要富集精氨酸以及脯氨酸代謝 （chx04010） 和MAPK 信號通路（chx39）。與此同時，他們也篩選了不同毛型相關的候選基因，包括KRT74、KRT100861184、LOC102177231、LOC102178767、LOC102179881、LOC106503203、LOC108638293、LOC108638298 和LOC 等。通過qRTPCR 檢測發現，2 種毛發類型之間的這些候選基因表達存在顯著差異，且大多與毛長呈顯著正相關。以上研究中大量與山羊皮、絨毛生長發育相關基因的發現都可作為改善皮、絨毛的理論研究基礎，進一步研究后可應用于生產實踐。

3 肉用型山羊基因敲除研究進展

目前，人類嚴重依賴牲畜來滿足肉類、奶類等日?；旧钚枨?。肉質性狀的控制、改良是畜牧業生產（包括豬、牛及羊等）的重要目標。因此，更好地了解肌肉發育及最終生長結果的生化特性是動物生產和肉類科學的主要挑戰課題。有關肌肉的研究能使養殖者了解動物的肌肉生長特性，從而更好地管理豬、牛及羊等，最終提高肉用型動物的經濟效益。為了在短期內迅速培育優良品種，對牲畜進行基因改造成為最好的策略之一?；蚬こ毯娃D基因的優勢可在短時間內顯著提高牲畜生產性能，增加經濟效益。肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）是動物體內天然產生的蛋白質，是一種眾所周知的骨骼肌發育負調節因子，具有抑制動物肌肉生長的功能。1997 年，美國約翰霍普金斯大學的Mcpherron 博士首次發現MSTN 是影響肌肉生長的最主要的代謝限制因子[14]。MSTN 蛋白由MSTN 基因編碼，位于2 號染色體2q32.2；它在3 個外顯子中編碼375 個氨基酸，占據大約8 kb 的位置。MSTN 基因編碼區自然突變導致表達量減少，敲低或敲除MSTN 會導致肌肉量增加，這一發現被認為是研究提高肌肉量和發展肉用型家畜的重大成功。MSTN基因突變可導致豬、牛、羊和人類出現肌肉肥大或雙?。―M）表型，而MSTN 的過表達則與肌肉萎縮有關。Zhang 等[15]利用CRISPR/Cas9 和體細胞核移植相結合的方法構建了位點特異性敲入阿巴斯絨山羊模型，將FAT1 基因特異性插入山羊MSTN 位點，實現了FAT1插入與MSTN 同步突變。劉姣[16]在陜北白絨山羊實現了這2 個基因的同時編輯，并且發現MSTN 敲除后絨山羊的能量和蛋白質代謝相關通路被影響，從而促進了肌肉生長。同年，為了對比CRISPR/Cas9 和轉錄激 活 因 子 樣 效 應 物 核 酸 酶 ［transcription activator-like （TAL ） effector nucleases，TALENs］這2 種基因編輯技術在大型動物中進行基因組編輯的差異, Zhang 等[17]通過構建絨山羊模型應用CRISPR/Cas9 和TALENs 技術在多個水平上敲除MSTN 基因。結果發現，CRISPR/Cas9 獲得MSTN 的突變頻率是TALENs 的8.5 倍。相比于TALENs 技術，CRISPR/Cas9 更精確、效率更高，具有顯著優勢。這可能也是CRISPR/Cas9 技術在生物技術領域成為首選的基因編輯技術，獲得一致認可的原因之一。Kumar等[18]評估了MSTN 下調對山羊成肌細胞中MRF 基因家族（MyoD、Myf5）、follistatin（FST）和IGF（IGF-1 和IGF-2） 表達的影響。結果表明，MSTN 下調導致MyoD 表達上調，Myf5 和FST 表達下調。此外，在培養4 d 后，成肌細胞增殖增強了4 倍，證明了MSTN基因位點編輯可用于轉基因山羊的生產培育，以增加肌肉質量、提高屠宰率并增加經濟效益。CRISPR/Cas 介導的是一種包括間隔獲取、crRNA （CRISPR RNA）生物發生/表達和靶標干擾3 個機制步驟在內的微生物免疫應答反應，位點特異性Cas9 生成的位點特異性雙鏈斷裂（DSB），在低等生物中能有效刺激同源重組 （homologous recombination，HR） 通路約10 000 倍，憑借此方法可以更好地提高糧食生產，如肉類的生產效率。

脂肪是肌肉的重要組成成分。在過去45 年中，由于動物遺傳、營養和管理的進步及加工技術的變化，零售肉類的脂肪含量大幅下降。肉類和肉制品中總SFA 和反式脂肪酸 （TFA） 含量降低，并富集n-3 PUFA 濃度。飲食與人類非傳染性疾病發病率存在關聯，使人們對開發新型低致病的食物生產系統產生濃厚興趣。與羊肉或牛肉相比，某些家禽的脂肪含量較低，多不飽和脂肪酸含量較高，TFA 濃度較低。改變羊肉、牛肉等的脂肪酸譜在很大程度上取決于攝入植物類型、微生物脂肪分解及瘤胃中膳食脂質的微生物氫化，這是單胃和反芻動物肉類脂質組成差異的主要原因之一。晝夜節律調節因子2 （period circadian protein2，PER2）是一種主要的生物鐘基因，與各種非反芻動物的細胞增殖和脂質代謝密切相關。Gao 等[19]從斷奶山羊中分離瘤胃上皮細胞（REC），用免疫熒光法測定細胞中時鐘蛋白 （clock protein）CLOCK 和PER2 蛋白的豐度，使用短干擾RNA 敲除模型研究PER2 的作用，并使用丁酸鈉評估上調PER2 的效果，以探究山羊REC 中生物鐘相關的mRNA 豐度，并確定PER2 對細胞增殖和SCFA 轉運體（脂代謝、細胞增殖和凋亡相關基因）mRNA 豐度的影響。結果表明，CLOCK 和PER2 可能在控制細胞增殖、SCFA 和脂質代謝中發揮作用，從而得以改變山羊的肉質。相關肉類的研究在農場動物身上還有很多，如通過CRISPR/Cas9 技術敲除MSTN 調控中華黃牛生長性狀； 利用CRISPR-Cas9 系統編輯豬IGF-2 調控元件來改善豬的生長速度，在不影響其肉質的情況下以此改善豬的產肉量等。由此可見，基因編輯技術為提高畜牧業生產力和應對全球畜牧業生產可持續性提供了理論基礎和可行方案。

4 山羊作為試驗模型基因敲除研究進展

相比于牛、馬等大型哺乳動物，山羊生長周期短、飼養成本更低、更易管理。因山羊對環境的適應性普遍較高、易飼養，所以經常被用來作為研究某一特定基因選擇性表達的模型動物，參與科學技術的更新、互作及相關傳染病的研究。

壓力性尿失禁 （stress urinary incontinence，SUI）是女性人群中常見的健康問題，影響女性的生活質量，但目前還沒有適合大部分患者的治療方法。由于倫理問題限制，患SUI 的靈長類動物模型無法構建，這使得農場動物模型成為最佳選擇。Amend 等[20]為研究SUI 的發病機制，通過CRISPR/Cas9 技術建立山羊病理模型，在規定的條件下誘導尿失禁，模擬已知的SUI 危險因素（如分娩或手術損傷等）后，發現與兩足動物相比，四足動物的腹部腫塊不會直接壓迫盆底，膀胱的壓力較小。此外，大型動物還可以使用標準儀器進行尿道手術。這為臨床研究中改進手術器械或開發新型器械提供了參考依據。

同時，CRISPR/Cas9 和不同的技術結合極大地促進了家畜基因編輯的發展。Fan 等[21]詳細地描述了使用CRISPR/Cas9 和體細胞核移植 （somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術相結合的策略，即從構建山羊CRISPR/Cas9 靶向載體開始，到將克隆胚胎轉移到雌性受體的試驗過程。利用 CRISPR/cas9系統可構建穩定敲除不同基因的細胞系，張志飛等[22]利用CRISPR/Cas9 系統以普通山羊細胞為模型敲除色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)1，成功建立了TPH1 基因穩定敲除的山羊乳腺上皮細胞系。

山羊痘病毒（goat pox virus，GTPV）是山羊痘的病原體，在山羊中較為流行。GTPV 會引起發熱、皮膚結節、呼吸道病變和淋巴結腫大等癥狀。在我國，主要的山羊痘疫苗毒株為AV41（GTPV-AV41），該疫苗株源于1959 年青海分離的GTPV-AV40 菌株。Zhu 等[23]考慮到GTPV-AV41 接種的安全性和毒副作用，采用同源重組和Cre（環化重組酶）/Loxp 系統，在不影響復制的前提下，刪除非必需基因片段，構建了與GTPVAV41 毒力和免疫調節功能相似的減毒山羊痘病毒（GTPV-TK-ORF）。體內和體外試驗結果均表明，GTPV-TK-ORF 比野生型GTPV-AV41 更安全，具有良好的免疫原性，可保護山羊免受GTPV-AV40 的毒力感染，減少其發病率和死亡率。

5 思考與展望

將高新生物技術應用于畜牧產業中，是中國畜牧業進步發展彎道超車的重要手段。隨著越來越多技術手段的開發，畜牧業產值在地方農業產值比重穩步增加，成為中國國民畜牧經濟的重要發展戰略之一?；蚓庉嫾夹g在畜牧業發展過程中的作用也越來越重要。隨著基因編輯技術的快速發展，鋅指核酸酶（ZFNs）、TALENs 和CRISPR/Cas9 系統已被應用于精確修飾生物體內的內源基因。目前，有研究者已經能從分子水平上開展試驗設計，使對山羊的研究在基因敲除的助力下更是不斷突破。山羊奶成分的改善、肉質的改良及山羊MSTN 基因的敲除改變肌肉生長速度等，都是目前山羊產業的研究熱點?；蚓庉嫾夹g適用性強，目前已經廣泛應用于其他動物的研究，如牛的基因組工程研究包括抗病性、根除過敏原（如β-乳球蛋白敲除）、產物生成（如動物種系）、引入有價值的特征及其健康調控（如心血管等疾病的糾正）等；豬的營養學研究（肉質改善、性別決定）、轉錄組分析及品種改良等也在有序開展。此外，基因編輯技術在小鼠、斑馬魚、綿羊、兔子及猴子等動物中均有涉及。

基因編輯技術作為近些年大熱的工程技術，對大、小型動物的個體層面、群體層面的研究都在不斷深入，但目前也有其自身缺陷和未能“探測”的領域，所以基因編輯技術這項工程的開展仍道阻且長。相信在研究人員的共同努力下，這項工程將完美竣工。未來包括山羊在內的大、小型動物的未知基因位點、基因性能及其他經濟、社會價值等都將更加明了，基因編輯技術在畜牧業、制造業及醫療行業等領域的地位將更加重要。