ONECUT2高表達介導胃癌復發患者5-FU化療耐藥

朱海峰, 陳述, 龍衛國, 王旭

(江蘇大學附屬醫院1. 化療科, 2. 肝膽外科, 3. 病理科, 4. 放療科, 江蘇 鎮江 212001)

據2020年國際癌癥研究機構發布的癌癥統計報告,胃癌居全球癌癥發病率的第四位[1］。然而目前在胃癌的治療方面,國際上仍沒有統一的標準[2］。在癌癥發展的早期,手術切除相對于化療來說是一種主流的治療手段,同時大量的化學小分子藥物也已經在胃癌治療領域被廣泛應用,包括單一化療和聯合用藥等[3-4］。此外,手術前或手術后采用化療對患者的總生存期及無病生存期都有較好的效果。然而許多胃癌患者會對目前所用的化療藥物產生明顯的耐藥性,因此進一步探索胃癌耐藥新的分子機制與治療靶點迫在眉睫。

Jacquemin等[5］于1999年首次報道了One cut結構域家族成員2(ONECUT2)。作為ONECUT轉錄因子家族成員之一,ONECUT2蛋白通過兩個DNA結合結構域(一個Homeobox結構域和一個Cut結構域)與特定的DNA序列結合進而調控多個靶基因的轉錄。近年來研究表明,ONECUT2在前列腺癌、肺癌和胃癌中均出現表達上調,且ONECUT2高表達與腫瘤細胞的增殖、轉移及干性相關[6-9］。Chen等[10］報道ONECUT2在胃癌中表達上調且與不良預后等臨床病理指標相關,這提示ONECUT2可能是胃癌潛在的治療靶點。此外,Shen等[6］發現ONECUT2可被化療誘導的miRNA靶向調控,對乳腺癌細胞的干性亦起到重編程的作用。然而,ONECUT2在復發胃癌的治療中發揮怎樣的作用仍需要進一步探究。

本研究擬利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫,分析ONECUT2的表達與胃癌患者的無病間隔期(disease-free interval,DFI)之間的關系,利用基因集富集分析(GSEA)方法尋找ONECUT2潛在影響的信號通路。并且在細胞水平和臨床研究方面,探究ONECUT2在胃癌中作為治療靶點的可行性。

1 材料與方法

1.1 胃癌組織標本來源與收集方法

30例胃癌組織均來自江蘇大學附屬醫院普外科,所有組織均為專業病理科醫師選取。本研究符合江蘇大學附屬醫院的倫理委員會相關規定(倫理編號:KY2021K0901),所有標本提供者均簽署知情同意書。納入標準:① 經組織病理學證實為胃腺癌;② 手術方式為胃癌根治術;③ 胃鏡病理確診為復發;④ 具有完整的臨床病史資料。排除標準:① 除胃癌外,患有其他原發惡性腫瘤;② 合并嚴重感染、自身免疫性疾病等并發癥無法耐受化療患者。檢測患者ONECUT2表達所用組織為手術切除的胃癌組織,采集時立即取1 cm3大小并加入Trizol充分研磨,置于-80 ℃冰箱長期保存。

1.2 TCGA數據分析

TCGA胃癌患者的ONECUT2表達數據和對應的臨床信息均從UCSC Xena網站下載[11］。為了鑒定在胃癌中有意義的指標,胃癌患者根據ONECUT2表達水平的中位值分為高表達(High)和低表達(Low)兩組?；熜畔⑾螺d自TCGA網站的GDC數據集。RNA測序的數據以Log2(歸一化計數+1)表示。

1.3 GSEA分析

GSEA分析使用的數據下載自UCSC Xena網站。將來自TCGA數據庫的100個原位胃腺癌患者基因表達數據按照ONECUT2表達高低分為最高表達50組和最低表達50組。GSEA分析使用的是Windows 10系統的GSEA_4.1.0版本。錯誤發現率(FDR)設置為0.25,P值設置為0.05。

1.4 細胞培養與穩轉細胞株建立

人正常胃黏膜上皮細胞(GES-1)和7株人胃癌細胞系AGS、BGC823、HGC27、MGC803、MKN28、MKN45以及SGC7901均購自中國科學院上海生命研究所。293T細胞為本實驗室保存。所有細胞均使用含10%胎牛血清以及1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基培養,細胞培養在含5% CO2的37 ℃培養箱中。sh-ONECUT2和oe-ONECUT2病毒均購自上海吉瑪生物有限公司。sh-ONECUT2序列:sh-1,5′-CCGGAGCTGACAATGGAAA-3′;sh-2,5′-GCCAG-CTGGAAGAAATCAA-3′。將ONECUT2敲低的細胞分為sh-Ctrl組、sh-ONECUT2-1組和sh-ONECUT2-2組。將ONECUT2過表達的細胞分為oe-Ctrl組和oe-ONECUT2組。細胞以60%～70%密度接種并感染病毒48 h。穩轉株細胞培養在含1 μg/mL的嘌呤霉素培養基中。

1.5 RNA提取與qPCR

細胞或組織的總RNA提取使用Trizol(日本TaKaRa公司)按照說明書完成。逆轉錄PCR使用PrimeScript RT-PCR kit(日本TaKaRa公司)按照說明書完成。qPCR使用SYBR預混液(日本TaKaRa公司)在Viia7實時定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)上按照常規的循環體系完成:95 ℃ 5 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循環40次。相對mRNA表達量使用2-ΔΔCt進行分析,使用RPS18 mRNA作為內參進行標準化。引物序列:ONECUT2上游5′-GGAATCCAAAACCGTGGAGTAA-3′,下游5′-CTCT-TTGCGTTTGCACGCTG-3′;RPS18上游5′-GCGGCGGAAAATAGCCTTTG-3′,下游5′-GATCACACGTTCCACCTCATC-3′。

1.6 細胞毒性實驗

細胞毒性實驗使用CCK-8試劑(日本Dojindo公司)完成。細胞以10 000個/孔的密度接種在96孔板中培養過夜,然后更換含有不同濃度5-FU的培養基培養72 h。每孔細胞更換含10% CCK-8試劑的培養基在37 ℃孵育1 h。最后使用多功能酶標儀(BIO-TEK,美國安捷倫公司)檢測D(450 nm)值,讀數作為細胞存活的指標。

1.7 胃癌復發患者5-FU化療效果評估

對30例胃癌患者手術切除的腫瘤組織進行ONECUT2mRNA測定,在此基礎上評估這30例胃癌復發患者對基于5-FU的聯合化療方案的敏感性。復發的患者通過電子計算機斷層掃描(CT)確定腫瘤的大小。通過計算每例患者復發后接受化療前后腫瘤體積大小(Eclipse軟件),得出腫瘤體積減少率。計算公式:腫瘤體積減少率(%)=(化療前腫瘤體積-化療后腫瘤體積)/化療前腫瘤體積×100%。

1.8 統計學分析

所有數據均使用GraphPad Prism 7.0分析。ONECUT2在正常胃組織與胃腺癌組織中的表達差異采用獨立樣本t檢驗。生存曲線使用Kaplan-Meier法分析并采用Log-rank檢驗。ONECUT2的表達量與胃癌患者臨床信息的相關性采用χ2檢驗。使用Cox比例風險回歸計算風險比(置信區間為95%)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ONECUT2在胃癌組織中表達上調且與胃癌患者更短的DFI相關

GTEx數據庫的174個正常胃組織、TCGA數據庫的36個正常胃組織和414個胃腺癌組織表達譜數據下載自UCSC Xena網站。將二者合并分析,結果顯示ONECUT2在腫瘤組織中比正常組織表達顯著升高(P<0.01),見圖1A?；赥CGA數據庫,將242個有DFI統計數據的胃癌患者,按照對應的腫瘤組織ONECUT2表達量分為高、低兩組,分析ONECUT2與DFI的關系。結果表明更高的ONECUT2表達量和更短的DFI相關(P<0.01),見圖1B。

A:正常胃組織和胃腺癌組織中ONECUT2表達水平比較;B:ONECUT2表達與胃癌患者DFI的關系

2.2 ONECUT2高表達的胃癌患者更容易復發

基于TCGA數據庫,將359例有復發數據記錄的胃癌患者,按照是否復發分為兩組,比較ONECUT2的表達量是否有差異。結果顯示,復發的103例患者胃癌組織ONECUT2表達量(10.39±0.19)與無復發的256例患者(9.791±0.13)相比顯著升高,差異有統計學意義(t=2.56,P<0.01)。

2.3 ONECUT2高表達與外源藥物代謝通路相關

基于TCGA數據庫,利用GSEA分析各50例ONECUT2最高表達和最低表達的患者轉錄組測序數據。結果顯示,在Hallmarks和KEGG這兩個基因集中,異生物質代謝通路以及細胞色素P450藥物代謝通路被顯著富集。見圖2。

圖2 GSEA分析與ONECUT2高表達相關的代謝通路

2.4 5-FU藥物細胞毒性實驗

2.4.1 驗證ONECUT2在不同細胞中的表達情況 與正常胃黏膜上皮細胞GSE-1相比,ONECUT2在胃癌細胞中表達均升高(P<0.01)。根據圖3A的結果,挑選HGC27細胞進行ONECUT2敲低,MGC803細胞進行ONECUT2過表達。結果顯示在HGC27細胞中,與sh-Ctrl組相比,sh-ONECUT2-1和sh-ONECUT2-2組ONECUT2表達明顯降低(P<0.05);而在MGC803細胞中,與oe-Ctrl組相比,oe-ONECUT2組ONECUT2表達明顯升高(P<0.01),見圖3B、C。

A:ONECUT2在不同胃癌細胞中的mRNA表達情況;B:qPCR檢測ONECUT2敲低后的相對表達量;C:qPCR檢測ONECUT2過表達后的相對表達量;a:P<0.01,與GES-1細胞相比;b:P<0.05,與sh-Ctrl組相比;c:P<0.01,與oe-Ctrl組相比

2.4.2 ONECUT2敲低細胞對5-FU處理更敏感 采用不同濃度的5-FU處理HGC-sh-ONECUT2細胞,結果顯示,與sh-Ctrl組相比,sh-ONECUT2-1和sh-ONECTU2-2組細胞的5-FU IC50值顯著降低(圖4A)。采用不同濃度的5-FU處理MGC803-oe-ONECUT2細胞,結果顯示,與oe-Ctrl組相比,oe-ONECUT2組細胞的5-FU IC50值顯著升高(圖4B)。

A:HGC27細胞;B:MGC803細胞

2.5 ONECUT2高表達的胃癌復發患者對5-FU化療不敏感

2.5.1 30例復發患者胃癌組織ONECUT2表達量分析 對30例患者手術切除的胃癌組織進行ONECUT2mRNA水平檢測,相對表達量>0.5為高ONECUT2組,<0.5為低ONECUT2組。結果顯示,高ONECUT2組有19例患者,低ONECUT2組有11例患者。見圖5。

圖5 30例胃癌組織ONECUT2 mRNA水平

2.5.2 30例復發患者5-FU化療效果 結果顯示,低ONECUT2表達的患者對5-FU化療更敏感,腫瘤縮小的體積與ONECUT2表達量呈顯著負相關(R2=0.694,P<0.01)。相反,高ONECUT2患者對5-FU化療響應不具有一致性,甚至有些患者腫瘤體積反而增加(R2=0.020,P>0.05)。見圖6。

圖6 30例患者5-FU化療效果與ONECUT2水平相關性分析

3 討論

胃癌是我國發病率較高且預后較差的癌種之一。在胃癌發展的早期,一般首選手術切除[12］。對于不適合手術或已經發現遠端轉移的患者來說,化療則是首選治療方式。然而化療藥物的低響應率仍是一個亟待解決的問題。5-FU作為一線化療藥物,經常以單藥化療或聯合治療的方式應用于難以手術胃癌患者的治療中。即使已經有很多患者從目前批準使用的化療方案中獲益,但對這些藥物產生耐藥的分子機制仍不清楚。

ONECUT2在多種癌癥中呈現出表達上調的趨勢,對腫瘤的發生發展起到多重調節作用[13-15］。但ONECUT2是不是導致患者產生化療耐藥的關鍵基因仍不清楚。本研究通過分析TCGA數據庫發現,ONECUT2在胃癌腫瘤樣本中呈現高表達的趨勢,且高表達與更短的DFI相關。這說明ONECUT2高表達會顯著促進胃癌的進展。除此之外,ONECUT2高表達的患者胃癌復發的概率更高,這提示單一手術切除的治療方式對于ONECUT2高表達的患者并不是一個最優的選擇。因此需要進一步探究ONECUT2在胃癌中的功能及相關的分子機制。

腫瘤細胞可以通過某些癌基因調控細胞色素P450家族酶的表達,不僅可以促進腫瘤細胞對細胞代謝過程中產生的有害物質的分解,降低對細胞的毒性,還可以降解抗腫瘤藥物,抑制這些藥物引起的細胞生長受限和細胞凋亡[16］,導致細胞產生耐藥性。本研究GSEA相關數據表明,ONECUT2高表達與藥物代謝通路相關,其中異生物質代謝和細胞色素P450系統是同種和異種物質生物代謝轉換的關鍵通路[17］。ONECUT2可能通過上調這些通路中關鍵代謝酶的表達來實現細胞對化療藥物的耐受。但ONECUT2是否直接調控細胞色素P450家族酶的表達仍需進一步研究。

細胞毒性實驗表明,ONECUT2過表達的胃癌細胞對5-FU產生明顯的耐藥性。相反,敲低ONECUT2則會使細胞對5-FU的處理更加敏感。同時本研究表明,ONECUT2高表達的胃癌復發患者對5-FU的治療響應效果差。以上結果提示,ONECUT2表達的上調可能是胃癌細胞產生耐藥的原因,并且有可能是通過激活異生物質代謝相關通路來實現的。已有多項研究表明,5-FU和癌基因抑制劑聯合使用展現出較好的抗腫瘤效果?；?-FU的化療方案與HER-2靶向治療及PD-1免疫治療聯合使用展現出較好的抗腫瘤效果[18-23］,ONECUT2抑制劑CSRM617有望成為胃癌復發患者5-FU聯合治療的藥物之一。

綜上所述,ONECUT2在胃癌患者中表達上調,其高表達與異生物質代謝通路呈正相關。ONECUT2高表達促進胃癌細胞對5-FU化療的耐藥性,而敲低ONECUT2則增加胃癌細胞對5-FU化療的敏感性。ONECUT2高表達降低胃癌復發患者對5-FU治療效果的響應,而ONECUT2低表達的胃癌復發患者對5-FU治療效果響應較好。因此靶向ONECUT2有望為胃癌化療提供新的理論依據。