基于孟德爾隨機化方法探討炎癥性腸病與骨質疏松性骨折的因果關系

陳尚桐, 陳躍平, 宋世雷, 黃川洪

(1. 廣西中醫藥大學研究生院, 廣西 南寧 530001; 2. 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院創傷骨科與手外科, 廣西 南寧 530011)

骨質疏松癥是一種以全身骨量下降合并骨組織微結構損壞、骨脆性增加,易發生骨折為特征的全身性骨病[1］。骨質疏松性骨折是骨質疏松癥最嚴重的并發癥之一,其定義是指受到輕微外傷即發生病理性骨折[2］?；诙囗椦芯勘砻?全身性的炎癥反應與骨質疏松性骨折發生的關系密切,其中最為重要的病理機制在于骨髓間質干細胞在炎癥因子的介導下加速破骨細胞成熟,導致骨質疏松性骨折的發生[3-4］。炎癥性腸病包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病,是一種自身免疫性的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,且炎癥性腸病的發病率逐日上升[5］。炎癥性腸病能夠誘導全身炎癥反應,既往有研究表明炎癥性腸病可使患者骨密度降低,引發全身性骨質疏松癥,導致病理性骨折頻發,嚴重影響患者的身心健康[6］。目前炎癥性腸病患者骨密度降低的發病機制尚不明確,針對該類患者骨密度降低的治療仍缺乏有力的證據支持,炎癥性腸病與骨質疏松性骨折之間是否存在因果關系尚無基因層面的明確定論,因此學術界對于炎癥性腸病患者骨密度降低的問題仍未獲得足夠重視[7］。然而,骨質疏松性骨折作為老年患者致殘和致死的主要原因,進一步明確炎癥性腸病是骨質疏松性骨折發病的危險因素,對制定有效的預防及治療措施具有重要的指導意義。

孟德爾隨機化(Mendelian randomization,MR)能夠達到模擬隨機對照試驗的目的,以遺傳變異為工具變量,遵循等位基因在受孕時隨機分配且固定的原則,能排除混雜因素的潛在干擾,有效降低因果關系估計值的偏倚,加強了因果推斷[8］。因此本研究選取炎癥性腸病中潰瘍性結腸炎和克羅恩病,以及骨質疏松性骨折樣本進行孟德爾隨機化的研究,以明確炎癥性腸病與骨質疏松性骨折之間存在的因果關系。

1 資料與方法

1.1 研究設計

本研究將骨質疏松性骨折作為結局變量,選取與炎癥性腸病(暴露因素)中的克羅恩病與潰瘍性結腸炎顯著相關的單核苷酸多態性(SNPs)作為工具變量,使用兩樣本孟德爾隨機化分析的方法進行暴露因素與結局變量因果關聯分析。為驗證結果可靠性,采用異質性檢驗、敏感性分析、多效性分析來排除結果偏倚。本文采用了以下三個關鍵假設達成孟德爾隨機化滿足:① 工具變量與暴露因素之間存在較強的相關性;② 工具變量與暴露因素-結局變量關聯的任何混雜因素不相關;③ 工具變量只能通過與暴露因素的關聯影響結局。

1.2 數據來源

通過IEU數據庫分別獲得炎癥性腸病和骨質疏松性骨折的遺傳數據。其中克羅恩病與潰瘍性結腸炎的數據均來源于Liu JZ團隊的GWAS研究[9］,克羅恩病數據集的樣本量為20 883,SNPs數量為12 276 506;潰瘍性結腸炎樣本量為47 745,SNPs數量為156 116。骨質疏松性骨折的遺傳數據則來自于芬蘭數據庫(The FinnGen Biobank),該數據庫收集并分析了來自50萬芬蘭參與者的基因組和健康數據,其樣本量為173 619,SNPs數量為16 380 281。為避免因人種差異相關混雜因素,研究人群的遺傳背景選擇歐洲人種?；拘畔⒁姳?。

1.3 工具變量

以千人堿基對項目作為本次研究的參照[10］。選擇與暴露因素顯著相關并且相互獨立的SNPs,相關參數設置為:P<5.0×10-8,單個SNP的F>10,計算公式為F=β2/SE2,其中β為等位基因頻率,SE為估計標準誤差。為排除連鎖不平衡的干擾,設置連鎖不平衡參數r2閾值為0.001,千堿基對為10 000 kb。采用MR PRESSO檢驗將存在顯著異質性的SNP剔除,篩選出與暴露因素顯著相關的有效SNP作為本次研究的工具變量。

1.4 孟德爾隨機化分析

采用R 4.2.0中的“TwoSampleMR”包進行孟德爾隨機化分析,本次研究使用逆方差加權(IVW)法作為主要分析,評估暴露因素與結局之間存在的風險。采用MR-Egger回歸法、加權中位數(Weighted Median,WME)法、簡單模式(Simple Mode)法以及加權模式(Weighted Mode)法進行輔助因果推斷,以此評估IVW結果的可靠性,若上述結果的方向均與IVW結果一致,即認為孟德爾隨機化分析結果可靠,P<0.05為存在統計學差異。F值設定為>10,即表示不存在弱工具變量偏倚,計算公式為F=R2(N-2)/(1-R2)[11］,其中R2為暴露數據庫中由SNPs解釋的變異占比,N為暴露的GWAS樣本量。

1.5 異質性檢驗、敏感性分析、多效性分析

本研究采用IVW法、MR-Egger法進行異質性檢驗,當P>0.05時,認為SNPs之間不存在異質性。采用MR_leaveoneout_plot函數進行敏感性分析并將結果可視化,剔除單個SNP觀察是否對最終結果存在影響。采用MR_pleiotropy_test函數以及MR PRESSO法進行多效性分析,當P>0.05時,表示不存在多效性[12-13］。

2 結果

2.1 工具變量

在使用clumped函數去除連鎖不平衡后,克羅恩病剩余52個SNPs,潰瘍性結腸炎剩余88個SNPs。本次研究單一SNP對應的F值均>10,不存在弱工具變量偏倚,本結果可靠。

2.2 孟德爾隨機化分析結果

在克羅恩病與骨質疏松性骨折分析結果中,IVW法具有統計學意義[OR(95%CI):1.12(1.03-1.22),P=0.006],提示克羅恩病是骨質疏松性骨折的危險因素;WME法分析結果同樣證明克羅恩病合并骨質疏松性骨折風險增高,差異有統計學意義[OR(95%CI):1.15(1.01-1.32),P=0.02];MR-Egger回歸[OR(95%CI):1.16(0.94-1.44),P=0.15]、Simple Mode法[OR(95%CI):1.15(0.88-1.50),P=0.28]以及Weighted Mode法[OR(95%CI):1.16(0.97-1.39),P=0.10]不支持克羅恩病是骨質疏松性骨折的危險因素,但5種方法的因果效應方向均一致。在潰瘍性結腸炎與骨質疏松性骨折分析結果中,IVW法、MR Egger法、WME法的結果均具有統計學意義,OR(95%CI)分別為1.15(1.03-1.28),1.35(1.03-1.75),1.18(1.01-1.37),P均<0.05,提示潰瘍性結腸炎是骨質疏松性骨折的危險因素;Simple Mode法[OR(95%CI):1.15(0.86-1.55),P=0.32]以及Weighted Mode法[OR(95%CI):1.19(0.96-1.47),P=0.10]結果不支持克羅恩病是骨質疏松性骨折的危險因素,但5種方法的因果效應方向均一致。見圖1。數據可視化分析說明5種方法下暴露因素克羅恩病、潰瘍性結腸炎整體SNP的效應升高,結局變量骨質疏松性骨折的SNP效應同樣升高。并且當暴露因素SNP效應為0時,結局變量同樣為0,說明該結果不受水平多效性的影響。見圖2。

圖1 孟德爾隨機化分析森林圖

圖2 孟德爾隨機化分析結果圖

2.3 異質性檢驗、敏感性分析、多效性分析

異質性檢測中,克羅恩病與骨質疏松性骨折的IVW法P=0.55,MR-Egger法P=0.52;潰瘍性結腸炎與骨質疏松性骨折的IVW法P=0.23,MR-Egger法P=0.25,均提示SNPs之間并不存在異質性。漏斗圖呈現出大致對稱的形狀,提示本次研究受異質性的影響造成結果偏倚的可能性小(圖3)。敏感性分析采用MR_leaveoneout_plot函數逐個提出SNP后,克羅恩病與骨質疏松性骨折、潰瘍性結腸炎與骨質疏松性骨折的IVW分析結果與納入全部SNPs的分析結果接近,未發現對因果關聯估計值影響較大的SNP(圖4)。多效性分析中,克羅恩病與骨質疏松性骨折的MR_pleiotropy_test函數結果提示P=0.69,MR PRESSO法P=0.55;潰瘍性結腸炎與骨質疏松性骨折的MR_pleiotropy_test函數結果提示P=0.20,MR PRESSO法P=0.24;結果均提示本次研究不受水平多效性影響。

圖3 兩樣本孟德爾隨機化結果漏斗圖

圖4 “Leave-one-out”敏感性分析結果

3 討論

本次兩樣本孟德爾隨機化研究驗證了炎癥性腸炎和骨質疏松性骨折之間的因果關系。其中在克羅恩病與骨質疏松性骨折分析結果中,IVW法、WME法分析結果存在統計學意義,其余方法分析結果方向一致;在潰瘍性結腸炎與骨質疏松性骨折分析結果中,IVW法、MR Egger法以及WME法結果存在統計學意義,其余方法分析結果方向一致。因此該結果提示炎癥性腸炎和骨質疏松性骨折的因果效應保持穩定。Lewandowski等[14］對431例樣本研究發現,有7.3%的炎性腸炎患者合并骨質疏松癥,炎性腸炎患者患骨質疏松癥的風險顯著高于健康者。Ratajczak等[15］研究結果表明36%的炎性腸炎患者合并骨質疏松癥。Saadah等和Jin等[16-17］學者發現患克羅恩病的兒童及青少年相較于成人同樣存在較高骨密度降低的風險。Targownik等[18］研究結果表明,克羅恩病患者中一個或多個部位(雙側髖關節、股骨頸、大粗隆、腰椎)的骨質疏松性骨折風險相對增加約50%。Hidalgo等[19］的Meta分析中,炎性腸炎與骨質疏松性骨折發生風險存在顯著相關性。Bartko等[20］在531例炎癥性腸病患者的臨床研究中發現,炎性腸炎與老年患者的髖部骨折密切相關,并且克羅恩病女性中死亡風險顯著升高。Wong等[21］針對小兒炎癥性腸病的研究結果表明,炎性腸炎能夠引起全身的慢性炎癥,即使不使用糖皮質激素,椎體骨折的風險也會增加。本次孟德爾隨機化結果與上述臨床觀察一致,進一步說明了結果的可靠性。

目前,炎癥性腸病被認為與骨量降低、脊柱炎、關節炎以及全膝關節置換術后并發癥等骨科疾病關系密切[22-23］。有研究表明炎癥性腸病患者體內的鈣、鎂、鋅和磷等電解質水平偏低,鈣、鎂、鋅、磷的代謝異常均能誘導骨質疏松性骨折的發生[24-26］。炎癥性腸病患者腸道吸收不良,維生素D、維生素K的缺乏同樣是影響患者骨密度的重要因素[27-28］。炎癥性腸病誘導的全身炎癥是導致骨質疏松性骨折的又一重要原因[29］。本研究中rs2188962位于5號染色體上、是C5orf56基因的內含子,rs1887428位于9號染色體上、是JAK2基因5′端的非翻譯區,有文獻報道稱該類遺傳變異與全身炎癥的關系密切[30-31］。學術界普遍認為核因子κB受體活化因子配體(RANKL)與骨保護素(OPG)比值的失衡在炎癥性腸病導致骨質疏松癥中起到關鍵的作用。炎癥性腸病通過全身多種免疫細胞介導引起全身炎癥反應,大量細胞因子在該過程中被激活,例如腫瘤壞死因子(TNF)、白介素1(IL-1)或IL-6等,該類細胞因子通過免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)蛋白介導的SYK信號通路參與破骨細胞的活化,并且能夠通過下調OPG的表達,上調RANKL的表達,以此來增強破骨細胞功能,并抑制成骨細胞功能[32］。全身炎癥反應同樣能夠激活RANKL,激活的RANKL與破骨細胞表面的核因子κB受體活化因子(RANK)結合,進而激活破骨細胞。在RANK和RANKL相互作用下,最終導致骨質疏松癥的發生。此外,文獻報道RNA測序結果提示在結腸炎的微炎癥環境刺激下,骨髓間充質干細胞中的Wnt信號傳導下調,導致結腸炎小鼠的骨髓間充質干細胞在微炎癥環境下傾向于分化為脂肪細胞而不是成骨細胞,因此可以通過外泌體的骨靶向藥物作用緩解炎癥性腸病中的成骨細胞損失和骨質流失[33］。目前,間充質干細胞/基質細胞療法已成為治療炎癥性腸病的新興治療方式,主要是通過分泌抗炎物質、改善微環境以及免疫調節來治療炎癥性腸病,或許間充質干細胞/基質細胞療法能成為預防炎癥性腸病導致的骨質疏松性骨折的重要治療手段,這仍需要進一步研究。

本研究中的IVW法結果表明,克羅恩病和潰瘍性結腸炎是骨質疏松性骨折的高危因素,考慮到遺傳變異的作用時間長,作用效果穩定,因此可以把骨質疏松性骨折列為炎癥性腸病的潛在并發癥之一。近年來,炎癥性腸病在我國發病率呈顯著上升的趨勢,且克羅恩病的發病人群多見于青少年,因此有必要在炎癥性腸病患者中進行骨質疏松指標的篩查,若診斷為骨質疏松癥,應及時及早行抗骨質疏松治療,防止骨質疏松性骨折的發生。但本次研究也存在局限性:① 本研究納入的GWAS數據為歐洲族裔,后續還需要在東亞人及其他族裔中進行孟德爾隨機化分析;② 納入數據缺少具體國家、地域及性別、年齡等,未能進行分層分析,研究結果可能存在偏倚。