生存素與細胞分裂周期相關蛋白5在胃癌及胃間質瘤中的表達及其臨床意義

包潔, 高小姣, 韓瑋, 王慶華

(江蘇大學附屬昆山醫院1. 消化內科, 2. 病理科, 3. 普外科, 江蘇 昆山 215300)

近年來,由于生活方式與飲食方式的改變,消化道腫瘤發病率呈上升趨勢,其中,胃癌與胃間質瘤是最常見的兩種胃腫瘤[1-2］。胃癌是來源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤,胃間質瘤則是來源于間葉組織的腫瘤,故兩者腫瘤性質、惡性程度及預后截然不同[3-4］。雖然將胃間質瘤定義為交界性腫瘤,但其仍有惡性特征,危險程度與核分裂象較高者復發風險也隨之增加,嚴重影響患者預后[5］。研究表明,參與胃癌發生發展的部分重要癌基因,同樣也參與胃間質瘤的發生且致患者預后不佳[6-7］。生存素是凋亡抑制蛋白家族重要成員之一,同時在胃癌與胃間質瘤的發生中起重要作用[8-9］。然而,單獨檢測生存素表達并不能充分評估胃癌與胃間質瘤的臨床病理[10-11］。因此,本研究通過數據庫挖掘出與生存素表達密切相關的細胞分裂周期相關蛋白5(cell division cycle associated protein 5,CDCA5),并擬用免疫組化進一步確認兩者在評估胃癌與胃間質瘤的臨床病理中的價值,并通過數據庫預測兩者共表達可能的機制以及相互作用關系。

1 材料與方法

1.1 數據庫分析

首先,利用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)檢索生存素的編碼基因BIRC5(baculoviral IAP repeat containing 5)與CDCA5在胃癌組織與癌旁組織中的表達差異,并應用Spearman相關檢驗分析兩者相關性;然后,在該數據庫中,分析與BIRC5mRNA表達相關度最強的前十個基因。其次,采用PROMO數據庫(http://alggen.lsi.upc.es/recerca/frame-recerca.html)預測人組織中可能作用于CDCA5與BIRC5啟動子(-2 000 bp)的轉錄因子,查詢是否有共同的轉錄因子,探尋可能的共表達機制。接著,利用HDOCK預測生存素蛋白與CDCA5蛋白之間的相互作用,根據分子直徑,將生存素設定為受體,CDCA5為配體,根據兩者相互作用評分,選取前三模擬構建結合區域示意圖,并分析相互作用位點數。

1.2 組織樣本

收集從2015年1月至2021年1月于江蘇大學附屬昆山醫院普外科行胃癌根治術或胃腫瘤切除術獲取的胃癌組織(76例)、胃間質瘤組織(63例)及距腫瘤邊緣5 cm對應的癌旁/瘤旁組織。其中,胃癌患者男34例,女42例,平均年齡(64.55±12.88)歲;胃間質瘤患者男31例,女32例,平均年齡(62.59±11.26)歲。所有胃癌與胃間質瘤患者臨床及病理資料完整,包括性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、淋巴管侵犯、TNM分期、核分裂象、NIH危險度分級及病理類型等。本研究獲得江蘇大學附屬昆山醫院倫理委員會批準,并獲得患者知情同意。

1.3 主要試劑和儀器

SP Rabbit &Mouse HRP試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司;生存素兔多克隆抗體和CDCA5兔多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司;蘇木素染色液購自美國Sigma公司。

醫用天平購自上海第二天平儀器廠;倒置顯微鏡購自日本Nikon公司;醫用切片機購自上海阿兵食品機械有限公司;醫用烤片機、電熱恒溫烘烤箱購自上海躍進醫療器械一廠。

1.4 免疫組化檢測生存素與CDCA5表達

取“1.2”中收集的胃癌、胃間質瘤及對應的癌旁/瘤旁組織石蠟切片,行免疫組化染色。① 脫蠟水化:二甲苯透明3次(分別10 min、5 min和3 min),無水乙醇5 min,90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各3 min,水洗1 min;② 抗原修復:枸櫞酸鈉高壓鍋煮沸20 min;③ 封閉:PBS沖洗3次,加過氧化物酶孵育10 min;④ 一抗孵育:PBS沖洗3次,滴加一抗工作液4 ℃孵育過夜;⑤ 二抗孵育:PBS沖洗3次;滴加HRP標記的鏈霉親和素孵育30 min;⑥ DAB顯色:PBS沖洗3次,滴加DAB孵育8 min,PBS沖洗后用蒸餾水終止染色;⑦ 復染、脫水、封片:蘇木素復染1 min,經70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇浸泡各3 min,二甲苯浸泡5 min,封片。生存素兔多克隆抗體和CDCA5兔多克隆抗體為一抗,用PBS將一抗稀釋為1∶250混合液,并用PBS作為陰性對照。

采用免疫反應積分(immunoreactive score,IRS)法分析染色結果,包括染色強度評分(intensity score,IS)與染色細胞比例評分(proportion score,PS)。其中,IS為0分,無染色;1分,輕微染色;2分,適度染色;3分,深度染色。PS為0分,0%;1分,1%～25%;2分,26%～50%;3分,51%～75%;4分,76%～100%。IRS=IS×PS,并設IRS≥4分為陽性表達,即至少有26%適度染色或76%輕微染色才能列入陽性表達,反之為陰性表達[12］。每個IRS均由兩名病理專業醫師評估,任何分歧通過討論來解決。

1.5 統計分析

2 結果

2.1 BIRC5與CDCA5在胃癌中的表達

GEPIA數據庫分析顯示,BIRC5mRNA和CDCA5mRNA在胃癌組織中的表達均明顯高于正常胃組織(P<0.01,圖1A),且兩者在胃癌組織中的表達呈正相關(r=0.79,P<0.01,圖1B)。此外,與BIRC5mRNA表達密切相關的前十個分子分別為CDCA5(r=0.79)、KIFC1(r=0.79)、KPNA2(r=0.77)、TK1(r=0.77)、ALYREF(r=0.75)、CENPA(r=0.74)、MRPL38(r=0.73)、TACC3(r=0.72)、CDCA4(r=0.72)和CENPM(r=0.71);其中,CDCA5與其相關性最強。

TPM:每百萬轉錄本;A:胃癌組織和正常組織中BIRC5 mRNA與CDCA5 mRNA表達水平比較;B:胃癌組織中BIRC5 mRNA與CDCA5 mRNA表達相關性

2.2 生存素與CDCA5在胃癌及胃間質瘤中的表達

免疫組化結果顯示,在胃癌和胃間質瘤中,生存素與CDCA5均在細胞核與細胞質中表達(圖2A),兩者表達量均明顯高于對應癌旁/瘤旁組織(P均<0.001,圖2B和2C)。在胃癌及胃間質瘤中,生存素與CDCA5表達均呈一定的正相關(r胃癌=0.410,P<0.001;r胃間質瘤=0.347,P<0.05;圖2D)。

#:P<0.001,與對應的癌旁/瘤旁組織相比;A. 光學顯微鏡下觀察(×100);B. 胃癌與癌旁組織中生存素與CDCA5表達差異;C. 胃間質瘤與瘤旁組織中生存素與CDCA5表達差異;D. 胃癌與胃間質瘤中生存素與CDCA5蛋白表達相關性

2.3 生存素和CDCA5表達與胃癌、胃間質瘤患者臨床病理參數相關性分析

在76例胃癌患者中,生存素陽性43例,CDCA5陽性40例。由表1可見,生存素表達與腫瘤直徑、淋巴管侵犯及TNM分期相關(P均<0.05),而與年齡、性別及分化程度無關(P均>0.05);CDCA5表達與腫瘤分化程度、TNM分期相關(P均<0.05),而與年齡、性別、腫瘤直徑及淋巴管侵犯無關(P均>0.05)。

表1 生存素與CDCA5在胃癌中的陽性表達及其與臨床病理參數的相關性

在63例胃間質瘤患者中,生存素陽性40例,CDCA5陽性39例。由表2可見,生存素表達與核分裂象及NIH危險度分級相關(P均<0.05),而與年齡、性別、腫瘤直徑及病理學分類無關;CDCA5表達與腫瘤直徑及NIH危險度分級相關(P均<0.05),而與年齡、性別、核分裂象及病理學分類無關。

表2 生存素與CDCA5在胃間質瘤中的陽性表達及其臨床病理參數的相性分析

2.4 生存素和CDCA5共陽性表達及其與胃癌、胃間質瘤患者臨床病理參數的關系

在76例胃癌患者中,生存素與CDCA5均為陽性者26例。由表3可見,生存素與CDCA5共陽性表達與腫瘤直徑、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及TNM分期相關(P均<0.05),而與年齡及性別無關(P均>0.05)。

表3 生存素與CDCA5在胃癌中共陽性表達與臨床病理參數的相關性分析

在63例胃間質瘤患者中,生存素與CDCA5均為陽性者27例。由表4可見,生存素與CDCA5共陽性表達與腫瘤直徑、核分裂象及NIH危險度分級相關(P均<0.05),而與年齡、性別及組織學類型無關(P均>0.05)。

表4 生存素與CDCA5在胃間質瘤中共陽性表達與臨床病理參數的相關性分析

2.5 數據庫預測作用CDCA5與BIRC5啟動子的轉錄因子

PROMO數據庫預測發現,有20個轉錄因子可作用于CDCA5啟動子序列,有19個轉錄因子可作用于BIRC5啟動子;其中,13個轉錄因子可同時作用于CDCA5與BIRC5啟動子,分別為AP-2αA、C/EBPβ、ER-α、FOXP3、GR-α、GR-β、IRF-2、p53、Pax-5、RXR-α、TFⅡD、TFⅡ-I和YY1。見圖3。

AP-2αA:轉錄因子激活蛋白2α;C/EBPβ:CCAAT/增強子結合蛋白β;ER-α:雌激素受體-α;FOXP3:頭叉狀轉錄因子3;GR-α:糖皮質激素受體-α:GR-β:糖皮質激素受體-β;IRF-2:干擾素調節因子2;p53:腫瘤蛋白p53;Pax-5:配對盒基因5;RXR-α:維甲酸受體α;TFⅡD:轉錄因子ⅡD;TFⅡ-I:通用轉錄因子Ⅱ-I;YY1:陰陽因子1

2.6 生存素與CDCA5相互作用預測

HDOCK Server分析發現,生存素蛋白與CDCA5蛋白之間存在多對相互作用,評分前三的結合區域見圖4。其中,預測評分最高的結合區域中,生存素蛋白與CDCA5蛋白之間存在67對相互作用位點。由此可見,生存素與CDCA5在胃癌組織中共表達的同時,還可能通過相互作用發揮生物學功能。

咖啡色示生存素蛋白,黃色、綠色和紅色示結合生存素蛋白不同區域的CDCA5蛋白

3 討論

胃癌與胃間質瘤是常見的胃腫瘤,尤其是中晚期胃癌患者預后往往更差;盡管胃間質瘤是交界性腫瘤,且有伊馬替尼等靶向藥物的應用,但高危、高核分裂象的胃間質瘤同樣具有較高的術后復發率及病死率[2,13］。在胃癌與胃間質瘤的發生過程中,部分癌基因的過表達可能是其發生發展的共同始動因素。生存素的主要功能是通過抑制凋亡終末效應酶和作用周期蛋白激酶發揮抗凋亡作用,以及通過作用染色體著絲點參與細胞有絲分裂[14］。由于參與調控細胞周期與細胞凋亡,生存素可誘導癌變,促進胃癌生長,并抑制細胞凋亡,致其與胃癌的侵襲轉移、化療耐藥、血管生成及患者預后密切關[14-15］。研究表明,在胃間質瘤中,生存素與危險程度分級有關,且為疾病進展的重要生物學標志,但其與年齡、性別、部位和組織學類型無關[16-17］。此外,生存素表達還受miR-494的負向調控,當miR-494表達異常下調時,生存素表達持續上調,從而導致胃間質瘤的發生發展[9］。本研究結果顯示,BIRC5mRNA及生存素在胃癌組織及胃間質瘤組織中的表達明顯高于對應的癌旁/瘤旁組織,且生存素在胃癌中的表達與腫瘤直徑、腫瘤分化程度和淋巴結轉移相關,在胃間質瘤中的表達與TNM分期、腫瘤直徑、核分裂象及NIH危險度分級等臨床病理學參數相關。由此可見,盡管胃癌與胃間質瘤起源不同,但均與生存素等癌基因的過表達相關。

CDCA5是細胞分裂周期相關蛋白家族的重要成員之一,參與調節細胞生長周期、促進增殖和抑制凋亡,并與其他細胞周期相關蛋白一同參與細胞的有絲分裂,從而促進胃癌的發生與進展[18-20］。本研究發現,相比于癌旁組織,CDCA5不僅在胃癌組織中表達明顯升高,在胃間質瘤組織中同樣呈異常高表達;其不僅與胃癌的腫瘤分化程度及TNM分期相關,也與胃間質瘤的腫瘤直徑及NIH危險度分級相關。由此表明,CDCA5異常高表達可能也參與胃間質瘤的發生發展。

此外,本研究發現,在胃癌組織與胃間質瘤組織中CDCA5與生存素表達均呈正相關,由此認為兩者異常高表達參與胃癌和胃間質瘤的發生發展。但兩者呈低度相關,可能與樣本量、患者年齡、性別等不可控的一些潛在干擾因素有關,后續有待進一步研究。此外,兩者共陽性表達與胃癌、胃間質瘤的多個臨床病理參數相關。研究表明,生存素與CDCA5在腫瘤細胞有絲分裂和細胞增殖中起重要的促進作用[14,20］。由此推測,兩者高表達可能導致細胞有絲分裂異?；钴S,進而促進胃癌、胃間質瘤的發生與進展。然而,兩者正相關的具體調控機制還有待深入研究。另外,生物標志物的聯合檢測通常能夠彌補單個標志物在診斷上的不足[21］。值得注意的是,聯合檢測生存素與CDCA5表達,在胃癌與胃間質瘤的臨床病理學參數評估中彌補了檢測單個分子的缺陷,具有一定的臨床價值。

另外,通過數據庫預測發現,CDCA5與BIRC5啟動子同時能被多個轉錄因子調控。轉錄因子可通過結合靶基因啟動子,調控靶基因的轉錄活性[22］。Jung等[23］研究表明,生存素受到YY1等多種轉錄因子的調控,但國內外關于調控CDCA5表達的轉錄因子的相關報道較少。因此,這或許是兩者表達呈正相關的重要因素之一,但需要進一步確認。不僅如此,HDOCK預測發現生存素與CDCA5兩種蛋白之間存在相互作用。由此推測,在多種轉錄因子的共同作用下,生存素與CDCA5在胃癌與胃間質瘤組織中呈高表達且共陽性表達,兩者經復雜的相互作用在胃腫瘤的發生發展中起重要作用。

綜上所述,生存素與CDCA5在胃癌與胃間質瘤中均呈高表達,且呈一定的正相關;兩者聯合檢測對胃癌腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移和TNM分期以及胃間質瘤腫瘤直徑、核分裂象和NIH危險度分級具有一定的評估作用。生存素與CDCA5表達異?？赡苁俏赴┡c胃間質瘤發生發展的共性,兩者表達異常在胃腫瘤發生發展中存在重要的內在聯系,后續還需要深入研究兩者相互作用、相互調控的可能機制。