超寬范圍的電化學酶生物傳感器與檢測技術?

王興國，王曉榮?，張拯民，龐 軍，儲震宇

(1.南京工業大學電氣工程與控制科學學院，江蘇 南京 211816；2.南京工業大學材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816)

生物電化學傳感技術是依靠生物組分與傳感材料間發生的特異性反應形成可被直接感知的電磁信號，從而能夠實現對生化反應中特定組分的濃度進行快速、精確的傳感檢測[8－9]。生物傳感技術起源于1962 年，美國科學家Clark 和Lyons 首次提出酶電極的概念[10]。此后，生物傳感科技得到飛速的發展[11－12]，同時，一部分研究成果也成功地實現產品的轉化，如血糖儀等[12]。大部分的生物傳感集中于生命醫療領域的應用，血液或體液中目標待測含量較低且波動范圍較窄，然而，發酵液中產物或底物濃度極高且波動范圍可達幾個數量級。因此，多數生物傳感器在檢測發酵體系中的待測物質前，需要對發酵液進行稀釋，增加了人工操作及檢測誤差率。部分學者嘗試建立在線軟測量模型，在特定的應用中取得一定效果[13]?；诖爽F狀，近十年，越來越多的研究人員專注于發酵用生物傳感器的開發，極大地推進了該領域的發展。實現“多組分”及“寬檢測范圍”的測量模式是發酵用生物傳感器的發展目標[14]。

規整的納米結構已被證明能顯著提升材料的傳感范圍。本研究組基于規整的納米結構開發出多種高靈敏度、寬范圍的新型酶生物傳感器[15－21]。在發酵檢測中，酶生物傳感器存在傳感器鈍化、重復性和穩定性等問題。較為成熟的解決辦法是傳感器與FIA(流動注射系統)相結合[22]。FIA 可以將反應生成物及時帶走，保證傳感器表面的反應長期穩定地進行，傳感器因此可以多次使用，適用于連續測量與監控。本研究組以普魯士藍修飾的石墨電極為核心傳感元件[23]，建立一種FIA 生物傳感器系統，采用三電極絲網印刷結構，實現了該系統的小型化，在此基礎上，結合寬范圍檢測技術，開發出離線葡萄糖生物檢測分析儀[24]。該分析儀檢測范圍為0.5 g/L～120 g/L，完全滿足發酵工業在線檢測要求，為我國發酵行業實現底物和濃度的在線檢測提供了理論指導及先進技術支持。

1 酶生物傳感器及FIA 系統

1.1 葡萄糖酶生物傳感器

發酵體系中，葡萄糖是發酵所需的主要碳源，也是絕大多數發酵產品的起始物質或原料，葡萄糖濃度的變化包含了產品品質、過程控制所需的重要信息。自制備的葡萄糖電化學酶生物傳感器為三電極體系，三個電極分別為工作電極(Working Electrode，WE)、參比電極(Reference Electrode，RE)、對電極(Counter Electrode，CE)這三個電極構成了葡萄糖傳感器，如圖1 所示。對電極與工作電極組成串聯回路，使電極上電流暢通，選用的材料是本身電阻小且不容易極化的碳漿料。參比電極材料選用容易處理、電位重現性好的AgCl。工作電極為反應區，該電極上固定有電催化劑普魯士藍(Prussian Blue，PB)膜和葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，GOD)，如圖1 所示。

圖1 葡萄糖電化學酶生物傳感器

檢測時，在GOD 的作用下，緩沖液中的葡萄糖(C6H12O6)能夠與O2反應生成葡萄糖酸(C6H12O7)和H2O2。H2O2是常見的氧化還原劑。反應式(1)表示了酶促反應的過程:

酶促反應過程，需要O2參與，因此，檢測池中溶液為特制的含氧緩沖溶液，用于解決反應時的“氧虧”問題。

酶促反應過程中會產生中間副產物H2O2，而PB 對H2O2具有高電催化活性，有“H2O2酶”之稱。PB(氧化態)在電極處發生得電子反應產生PB(還原態)，進而PB(還原態)與酶促反應副產物H2O2發生氧化還原反應產生還原電流，還原電流與待測物葡萄糖存在當量關系，可以計算出葡萄糖的濃度。其機理如反應式(2)、式(3)所示:

3.6 綜合人才缺乏 目前國內培養的假肢矯形器專業人才大部分偏重于假肢矯形器臨床裝配能力，計算機設計操作能力缺乏，而專門的計算機人才對假肢矯形器行業又知之甚少，因此很多假肢矯形器企業需要招聘計算機人才與原有的假肢矯形器裝配技術人員進行配合，雙方磨合時間長，效率低，因此，針對3D打印技術，培養假肢矯形器方面綜合的康復工程人才，是亟待解決的問題。

PB 膜由于優異的導電性能，將工作電極上獲取的電子直接傳送到酶的活性中心，加快了檢測速率。PB 膜在陰極電位處和酸性體系中很穩定，可以防止電極表面的損耗，降低了檢測電位，減少了共存物質的氧化，排除了因氧化所帶來的干擾。

傳感器是從催化反應有關物質的電極反應所得到的電流來確定反應物質濃度。在電化學中，Cottrell 方程描述了在受控電位實驗中電流相對于時間的變化，如式(4)所示:

式中:t為時間，i為t時刻的瞬時電流，n為電子數，F為法拉第常數，A為電極的面積，c0j為分析物j的初始濃度，Dj為j的擴散系數。

在反應池持續攪拌的條件下，溶液中物質的傳質過程由擴散傳質轉為對流傳質，活性物質可以迅速從溶液本體傳送至電極表面，在電極/膜界面，其電流方程為:

式中:ks是異相速率常數，Cp是電催化劑濃度，該值可以用表面濃度Γ和膜厚Φ來表示:

由式(5)和式(6)得:

表面濃度Γ與待測物濃度成正比，與酶的活性正相關。因此，待測物濃度與電極上的電流在一定范圍內呈線性關系。電極面積增大、減小PB 膜的厚度可增強響應電流。

1.2 PB 膜

在實際檢測裝置中，因多種因素影響，電極面積受到限制。在電極面積一定的情況下，通過增大PB膜的比表面積可達到與增大電極面積同樣效果。

自組裝法是一種制備PB 修飾電極的常用方法，該方法易控制PB 的形貌和厚度而被廣泛推廣。項目組通過自組裝技術控制合成液K4[Fe(CN)6]和FeCL3的濃度和合成速度成功合成出規則的普魯士藍納米立方體(PBNCs)。規則形貌的PB 納米立方體傳感材料膜可顯著提高材料的比表面積，擴大材料的催化位點，提升傳感器的檢測范圍和檢測靈敏度。PB 納米立方體顆粒電鏡圖如圖2 所示。

圖2 PB 納米立方顆粒電鏡圖

1.3 檢測電路

從原理來分類，電化學傳感器主要有3 種檢測方法:電流法、電位法和阻抗法。電流法是在電極上加上恒定電壓作為溶液中電活性成分進行電子傳遞反應的外加動力，通過檢測電流大小來分析相應被測物的濃度大小及變化。電位法是在零電流的條件下，利用電極電位和濃度間的關系將被測離子的活度轉換為電極電位進行測定的一種電化學分析法。電位法在某種程度上可以看成電流法當其工作電流趨向無窮小的一種極限情況。阻抗法是在兩個惰性電極上加上一定的交流電壓并測定電極上電流變化從而測得與溶液成分變化相關的阻抗變化。本研究組采用的是電流法，該方法操作簡單，且配合酶傳感器對溶液中成分的響應具有選擇性，線性度好，易于實現寬范圍檢測。

葡萄糖酶傳感器中，工作電極與參比電極之間的電勢，影響PB 能否實現可逆的氧化還原反應。電勢過低，電子運動不明顯，影響PB(還原態)產生速率；電勢過高，PB(氧化態)無法生成PB(還原態)。隨著反應不斷進行，工作電極中的電子不斷遷出，造成工作電極帶正電，改變了電極電勢，從而阻礙電極中的電子遷出，反應進程受阻，導致檢測失敗。因此，為保證反應進行，需借助恒電位電路，使參比電極與對電極電勢保持一致，工作電極對于參比電極呈負電性。圖3 為本研究組實現的葡萄糖酶傳感器檢測電路。

圖3 酶傳感器檢測電路

圖3 中，參比電極是非極化電極，具有恒定電位，不受溶液成分變化的影響，起著穩定工作電極電勢的作用。參比電極和對電極之間使用運放實現深度負反饋的恒電位電路，使對電極和參比電極的電勢始終保持一致。A 運放和B 運放需選用失調電壓和偏置電流較小的運放。R14、R15、C14、C15組成低通濾波電路。參比電極需緊靠工作電極，以減小溶液電阻。工作電極與參考電極之間保持－50 mV 的恒定電勢，可使電極具有最好的氧化活性。B 運放為跨阻放大器，工作電極通過跨阻放大器將nA 級電流轉換為可以測量的電壓信號。繪制PCB 板時，B運放的負輸入端和負反饋部分需進行開窗處理，以減少干擾。R9為傳感器輸出匹配電阻。R13為反饋電阻，需選用低溫漂精密電阻。C18為C0G 材質的濾波電容，用于低通濾波。圖3 中C 放大器實現了有源2 階巴特沃斯低通濾波器。檢測時，工作電極不斷向特制的緩沖液提供電子，在R13上形成電流。通過檢測R13兩端的電壓，即可得到工作電極產生的反應電流I的大小。

1.4 檢測方法和FIA 系統

酶傳感器的電流檢測法可以通過檢測電極上流過的電流大小來分析被測物的濃度。然而，在真實發酵體系中，會遇到很多問題:酶傳感器久置后，首次使用需要在攪拌的緩沖液中進行激活處理；酶的活性是一個不斷衰減的過程，該過程可導致零點漂移；發酵液中各種大分子物質在電極表面吸附，如不能及時清除，沉積的反應物會阻礙待測液體與傳感器的正常接觸，引起傳感器鈍化；緩沖液溫度變化導致零點漂移；超寬范圍檢測的線性度問題等。

為了解決以上問題，以葡萄糖為例，采用“酶傳感器＋FIA 系統”實現超寬范圍檢測，其結構如圖4 所示。

圖4 酶傳感器＋FIA 系統

圖4 中，FIA 是下述幾點的組合:①檢測池溶液體積的精確控制；②待測樣和標樣注入量的精確控制；③穩定的攪拌系統；④校準和檢測流程控制。

由式(7)可知，穩態電流I與檢測池中葡萄糖濃度成正比，即與待測樣品注射量成正比，與檢測池中緩沖液體積成反比。因此，檢測池溶液體積和待測樣的注入量的準確性直接影響測量精度?？刹捎貌竭M電機精確控制緩沖液體積減小誤差，量程為100 μL，0.1%精度的注射泵精確控制注射量。

式(7)中表面濃度Γ與酶的活性呈正相關。酶活性是否穩定將直接影響測量結果。而酶的活性長時間是不斷衰減的過程，且受溫度、激活時長等因素影響。因此，在真實發酵體系中，對葡萄糖酶傳感器的長期穩定性有著較高的要求。圖5 所示為將傳感器置于4 ℃的環境中冷藏，每隔5 d 進行葡萄糖靈敏度測試實驗的實驗結果。

圖5 長期穩定性測試

為減小酶活、溫度等因素對測量精度的影響，可通過FIA 系統對校準和檢測流程進行控制。FIA 系統，一方面將反應生成物及時帶走，避免傳感器鈍化，保證傳感器表面的反應長期穩定進行；另一方面通過定時校準和注入量控制，將待測樣濃度轉換到校準點附近，降低酶活變化的影響，提高測量精度以及系統的重復性、穩定性和測量范圍。FIA 系統的校準和檢測流程控制如圖6 所示。

圖6 校準和檢測流程

發酵過程葡萄糖底物的濃度范圍較寬(2 g/L～100 g/L)。自制的葡萄糖酶傳感器在高濃度仍有較好的活性，但線性度較差。該問題，可通過變更注射體積，將檢測池緩沖液中的濃度調整到標樣濃度附近加以解決。但待測樣注射體積小于2 μL 時，注射體積誤差難以滿足檢測精度要求，因此，注射體積最低為2 μL。

2 酶生物檢測儀與實驗測試

2.1 酶生物檢測儀

在三電極的葡萄糖酶傳感器分析體系基礎上，項目組成功研發超寬范圍檢測的離線生物分析儀，如圖7 所示。該分析儀可對真實發酵體系中的待測樣免稀釋直接進行測量，簡化了測量過程，為進一步完成在線檢測儀開發打下很好基礎。

圖7 葡萄糖生物分析儀

2.3 實驗測試

2.3.1 檢測精度測試

實驗在自主研發的離線生物分析儀上進行，對葡萄糖酶傳感器進行檢測精度測試。根據實驗需要，配制了0.1 g/L～400 g/L 不同濃度的葡萄糖樣品。實驗中，所有測試均使用同一枚電極芯片。使用采樣針向檢測池中分別注入2 μL、5 μL、20 μL、50 μL 和100 μL 不同濃度的葡萄糖溶液，檢測綜合誤差如表1 所示。

表1 檢測誤差

通過實驗室單次檢測結果可知:生物分析儀在0.5 g/L～320 g/L 的葡萄糖濃度范圍內均可滿足±2%的檢測誤差要求。多次實驗和發酵企業返回的測試數據表明:該分析儀檢測范圍為:0.5 g/L～120 g/L。完全滿足發酵企業2 g/L～100 g/L 的寬范圍檢測需求。此外，分析儀每次測量時間約50 s，符合在線檢測要求。

2.3.2 抗干擾測試

真實發酵過程中，葡萄糖檢測最常見的干擾物質為抗壞血酸(Ascorbic Acid，AA)和尿酸(Uric Acid，UA)以及同類型的還原性糖類。因為AA，UA氧化電位比較低，其干擾的可能性更大。如圖8 所示，當滴入0.1 mmol/L 葡萄糖溶液后會產生一個電流階躍信號，再滴入相同濃度的抗壞血酸時，電流沒有任何變化，重復實驗操作步驟，對尿酸也無任何電流響應。測試表明，由于酶的專一性，酶傳感器具有很高的抗干擾性能。

圖8 抗干擾測試

3 結論

針對發酵底物葡萄糖的檢測提出一種寬線性范圍酶傳感器。該傳感器在滿足檢測精度、穩定性、抗干擾等各項性能指標要求的前提下，可實現對0.5 g/L～120 g/L 范圍內葡萄糖濃度的快速檢測，完全滿足真實工業發酵體系中對葡萄糖濃度的在線檢測要求，為我國發酵底物和產物的在線檢測提供了先進技術支持。由于PB 材料能夠對不同的酶反應具有響應，可通過在PB 上固定不同的氧化酶，實現多組分檢測。這項工作正在進行中，目前部分組分存在信號強度、檢測線性范圍差異較大等問題。