ESD 對結直腸神經內分泌腫瘤患者療效的影響及Akt/mTOR 信號途徑參與機制研究

牛振楠，梁冬紅，劉 壯，孟嫦娟

神經內分泌腫瘤（neuroendocrine neoplasm，NEN）作為異質性腫瘤，起源于神經內分泌細胞，發病率較低，但隨著影像學和臨床診斷技術不斷提高，其檢出率和發病率呈現逐年增加趨勢， 常見于結直腸等部位[1，2]。 NEN 的發病較為復雜[3，4]，可能與遺傳、飲食和生活習慣相關，主要臨床癥狀為局部腫塊、頭痛、視野模糊等壓迫癥狀及肌無力、 醛固酮增多等神經內分泌癥狀，嚴重威脅患者生命安全。 現階段臨床治療NEN 以手術、化學治療、放射治療及靶向治療為主，并根據腫瘤分型、分期、發生部位等選擇適宜手段，且手術為首選方案[5]。 常規開腹切除因切口大、術后恢復慢，已逐漸被臨床摒棄[6]；內鏡切除術，如內鏡下黏膜切除術（endoscopic mucosal resection，EMR）可有效切除病灶，阻止癌變病灶的進展或轉移，但其在切除直徑＞2 cm 病灶方面存在一定局限性[7]。 內鏡黏膜下剝離術（endoscopic submucosal dissection，ESD）是在EMR 的基礎上發展而來的手術方式， 可完整切除病灶，降低復發率[8]，且已用于胃腸NEN 患者[9]，但具體應用于結直腸部位腫瘤研究及作用機制相對較少。因此筆者選擇146 例結直腸NEN 患者， 采用隨機信封法， 研究ESD 和常規內鏡切除術對患者臨床療效及作用機制，為臨床控制疾病進展、延長生存期等提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2014 年1 月至2019 年10 月在邢臺市第三醫院收治的146 例結直腸NEN 患者， 其中男性92例，女性54 例；年齡42 ～65 歲，平均年齡53.49 歲（標準差5.42 歲）；病灶直徑1.15 ～1.85 cm，平均直徑1.50 cm（標準差0.18 cm）；病理分級[10]，G132 例，G251 例，G363 例；直腸99 例，結腸47 例。 按隨機信封法將患者分成觀察組和對照組，每組73 例。對照組患者行EMR，觀察組行ESD。 觀察組男性49 例，女性24 例；年齡42 ～65 歲，平均年齡53.15 歲（標準差5.50 歲）；病灶直徑1.16 ～1.82 cm，平均直徑1.47 cm（標準差0.18 cm）； 病理分級，G114 例，G224 例，G335 例；直腸47 例，結腸26 例。 對照組男性43 例，女性30 例；年齡44 ～62 歲，平均年齡52.87 歲（標準差4.52 歲）；病灶直徑1.16 ～1.84 cm，平均直徑1.49 cm（標準差0.20 cm）； 病理分級，G118 例，G227 例，G328 例；直腸52 例，結腸21 例。

選擇標準：①均經病理組織檢查確診為NEN，且發病部位為結直腸[11]；②年齡18 ～75 歲；③均符合手術治療診斷，首次應用內鏡切除術或ESD；④入院前未經放化療等治療；⑤患者首次發病，病歷資料齊全，能正常溝通和交流；⑥知情同意研究方案。

排除標準：①合并惡性腫瘤者；②凝血功能障礙、出血性疾病者；③紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等自身免疫疾病者；④肝、腎、心等重要臟器衰竭者；⑤不配合者。

兩組患者性別、年齡、病理分級、病灶部位及病灶直徑比較，差異無統計學意義（χ2/t=1.058、0.336、1.454、0.784、0.635，P ＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 治療方法

手術由同一手術團隊進行，所有患者術前均進行手術指征確認。 術前禁飲、禁食至少6 h，并于術前給予鎮靜劑和解痙劑，在靜脈麻醉下行相應手術治療。

觀察組：給予常規ESD 治療。 具體步驟如下：采用日本Olympus CF-H260AI 型電子腸鏡判斷、 勾畫病灶， 并應用DUAL 刀在病灶區域0.5 cm 外沿電凝法標記；在病灶周邊注射混合液，主要為甘油果糖、腎上腺素和由美藍， 每次注射3 mL， 等待病灶肌層分離；再次應用DUAL 刀沿著標記點邊緣逐步切開，在鉤刀的輔助下在黏膜下層沿著原有基層剝離病灶黏膜，將完整瘤體送檢，同時確認基底和邊沿是否有腫瘤殘留物；徹底剝離后，應用熱活檢鉗充分止血，降低活動性出血事件發生。

對照組：給予常規EMR 治療。 在內鏡的輔助下充分暴露病灶基底，并探查病灶。 在病灶周邊注射混合液，主要為甘油果糖、腎上腺素和由美藍，關注病灶的抬舉征是否為陽性，選用適宜大小的圈套器對陽性病灶圈套，并應用電凝刀切除，針對體積較大的病灶可分批次切除，最后應用熱活檢鉗行相應創面關閉處理，以發揮止血功能。

術后24 h 密切監測患者生命體征，并給予止血、抑酸及抗感染等，于術后3、6、12 個月定期復查。

1.2.2 觀察指標

病變切除情況：記錄兩組患者治愈性切除、整塊切除及基底病灶殘余等情況。

手術情況：記錄兩組患者術中出血量、手術時間、住院時間、治療費用、病變組織直徑及病變組織厚度等。

生存質量：于術前和術后7 d 應用生存質量量表評估兩組患者生存質量[12]。 該量表包括食欲、精神、睡眠、生活能力、疲倦及疼痛等6 個維度，除生活能力每個維度滿分為5 分， 生活能力滿分為20 分。 分值越高，患者生存質量越差，該量表Cronbach’α 為0.789，信效度較好。

免疫功能：分別于術前和術后7 d 采集空腹肘靜脈外周血4 mL，流式細胞儀檢測兩組患者CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD4+/CD8+等免疫指標。

蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）：分別術前和術后7 d 采集空腹肘靜脈外周血4 mL，采用德國Hettich MIKRO220 型離心機，參數：3000 r/min，半徑8 cm，時間10 min，溫度-4 ℃；上清液為目標產物，應用美國Bio 公司Tek Synergy H1MF 型號全自動酶標儀，波長為450 nm，測定血清Akt 和mTOR 水平，所有操作均嚴格按照說明書進行。

并發癥： 記錄兩組患者圍術期并發癥發生情況，如術中穿孔、皮下氣腫及術后遲發性出血等情況。

復發情況：隨訪1 年，記錄兩組患者術后1 年復發情況。

診斷效能分析：以術后7 d 血清Akt 和mTOR 為檢驗變量，以術后是否復發為狀態標量，繪制受試者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲線，繪制曲線下面積（area under curve，AUC），分析Akt 診斷、mTOR 診斷和二者聯合診斷的靈敏度、特異度。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據分析。 計量資料符合正態分布，以均數± 標準差表示，組間行獨立樣本t 檢驗，治療前后行配對t 檢驗；計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗。 P ＜0.05 為差異有統計學意義，P ＜0.01 為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者病變切除情況比較

術后觀察組患者治愈性切除率和整塊切除率明顯高于對照組[83.56 %（61/73） vs 60.27 %（44/73）。χ2=9.801，P=0.002。 97.26%（71/73）vs 73.97%（54/73）。 χ2=16.074，P=0.000]，而兩組患者基底病灶殘余率差異無統計學意義[1.37%（1/73）vs 5.48%（4/73）。χ2=1.864，P=0.172]。

2.2 兩組患者手術情況比較

觀察組患者手術時間和治療費用明顯高于對照組，而術中出血量和住院時間明顯低于對照組（P ＜0.05）。 兩組患者病變組織直徑和病變組織厚度比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。 見表1。

2.3 兩組患者手術前后生存質量比較

術前兩組患者食欲、精神、睡眠、生活能力、疲倦及疼痛等生存質量各維度差異無統計學意義 （P ＞0.05）；術后7 d 兩組患者生存質量各維度水平明顯降低（P ＜0.05），且觀察組患者食欲、精神、睡眠、生活能力、疲倦及疼痛等生存質量評分明顯低于對照組（P ＜0.05）。 見表2。

2.4 兩組患者手術前后免疫功能比較

術前兩組患者CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD4+/CD8+等免疫指標差異無統計學意義（P ＞0.05）。 術后7 d，兩組患者CD3+CD4+和CD4+/CD8+水平明顯提高，CD3+CD8+水平明顯降低（P ＜0.05）；且觀察組患者CD3+CD4+和CD4+/CD8+水平明顯高于對照組，CD3+CD8+水平明顯低于對照組（P ＜0.05）。 見表3。

表3 兩組患者手術前后免疫功能比較Tab.3 Comparison of immune function before and after treatment between 2 groups before and after operation

2.5 兩組患者手術前后Akt 和mTOR 比較

術前兩組患者血清Akt 和mTOR 水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；術后7 d，兩組患者血清Akt和mTOR 明顯降低（P ＜0.05），且觀察組患者血清Akt和mTOR 明顯低于對照組（P ＜0.05）。 見表4。

表4 兩組患者手術前后血清Akt 和mTOR 比較ng/mLTab.4 Comparison of Akt and mTOR between 2 groups before and after operationng/mL

2.6 兩組患者術后并發癥比較

觀察組術后遲發性出血1 例（1.37%），穿孔2 例（2.74%），皮下氣腫1 例（1.37%）。 對照組術后遲發性出血4 例（5.48%），穿孔4 例（5.48 %），皮下氣腫5例（6.85%）。 兩組患者均出現術后遲發性出血、穿孔及皮下氣腫等并發癥，但差異無統計學意義（χ2=1.864、0.695、2.781，P=0.172、0.404、0.095）。

2.7 兩組術后復發情況比較

隨訪1 年，失訪3 例。觀察組患者復發率為4.17%（3/72），明顯低于對照組的22.54%（16/71），差異有顯著統計學意義（χ2=10.469，P=0.001）。

2.8 單獨和聯合診斷效能比較

血清Akt 臨界值為1.33 ng/mL，Akt 診斷的靈敏度為68.42%，特異度為70.16 %，AUC 為0.765[95%可信區間（confidence interval，CI）0.706 ～0.813]；血清mTOR 臨界值為0.049 ng/mL，mTOR 診斷的靈敏度為73.68%， 特異度為59.89%，AUC 為0.808 （95%CI0.749 ～0.851）；二者聯合診斷，其靈敏度為84.21 %，特異度為75.00%，AUC 0.878（95%CI 0.832 ～0.911）。見圖1。

圖1 Akt 診斷、mTOR 診斷和二者聯合診斷的ROC 曲線Fig. 1 ROC curves of Akt diagnosis, mTOR diagnosis and combined diagnosis

3 討論

NEN 起源于彌散神經內分泌系統， 可分布于全身不同器官和組織，以胃腸道等消化系統最為常見，以低血糖、皮膚潮紅、胰高糖素瘤及生長抑素瘤等為主要臨床癥狀，其生長緩慢、惡性程度低，若早期及時發現并對癥治療，將會明顯改善患者預后[13，14]?，F階段[15]，NEN 未見有效預防措施，手術是根治NEN 最有效的方式，傳統息肉切除術完全切除率僅為30%～50%，不僅存在較高復發率，而且具有創傷大、恢復慢等缺點，患者依從性較低。隨著內鏡技術應用于外科手術，EMR 的腫瘤清除率明顯高于傳統開腹手術， 術中損傷、侵襲小，術后并發癥發生率低，其安全性和有效性已得到臨床廣泛證實，但其在切除大體積病灶方面存在不足[16]。ESD 是在內鏡直視下應用專用醫療器械將病灶剝離正常黏膜，以徹底清除病灶、遏止疾病復發[17]，二者在NEN 治療中均有一定作用，但在治療效果、優勢和缺點等方面臨床尚未得出統一結論。有研究[18]證實，NEN 患者3 年生存率僅為52.64 %，預后較差。因而研究治療方式的作用機制，對疾病復發、預后的改善具有重要臨床意義。

ESD 在治愈性切除率、整塊切除率、生存質量和免疫功能提高等方面獨具優勢， 但ESD 手術時間和治療費用高于EMR。 Dinc S 等[19]大鼠實驗表明，ESD后創面比EMR 損傷大，手術時間較長。 ESD 可在內鏡的幫助下， 應用專用醫療器械完全剝離病灶組織，而病灶的完全剝離與疾病復發、免疫功能和生存質量明顯相關。 賀德志等[20]證實，ESD 可有效提高病理組織切除率， 降低并發癥， 但術后復發率仍較高，為23.64%，略高于筆者研究，可能與樣本量、手術方式相關。Akt 是高度保守的蛋白激酶，是磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）的下游因子；mTOR 是Akt 信號下游作用靶點， 可直接磷酸化或者阻滯結節性硬化復合物， 以激活mTOR信號通路，Akt/mTOR 信號通路的激活與腫瘤細胞的增殖、分化密切有關[21]。筆者研究結果表明，兩組患者血清Akt 和mTOR 明顯降低，且觀察組患者血清Akt和mTOR 明顯低于對照組（P ＜0.05），即臨床切除結直腸NEN，提高臨床療效、改善患者生存質量與降低Akt/mTOR 信號通路相關，且Akt 和mTOR 單獨和二者聯合檢測可應用于預測結直腸NEN 術后復發，臨床可通過術后Akt 和mTOR 指標預測疾病復發。

綜上所述，ESD 應用于治療結直腸NEN 患者可有效提高治愈性切除率和整塊切除率，改善患者生存質量，恢復免疫功能，降低術后1 年復發率，且血清Akt 和mTOR 單獨和二者聯合診斷可應用于預測結直腸NEN 術后復發。