非小細胞肺癌患者血清miR-873和miR-138-5p表達水平及其與免疫微環境及預后的相關性分析

劉 捷，楊玲玲，程秋霞，高 瞻（.重慶醫科大學附屬巴南醫院呼吸與危重癥醫學科，重慶 400054；.陸軍軍醫大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，重慶 400037）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是全世界癌癥相關死亡的主要原因，我國是NSCLC 高負擔國家，據2020年全球癌癥統計我國有82 萬例肺癌新診斷病例和71.5 萬例肺癌相關死亡病例[1-2]。腫瘤免疫微環境（tumor immune microenvironment，TIME）是腫瘤細胞賴以生存的周圍微環境，利于腫瘤細胞生長、增殖和侵襲，并參與免疫抑制和促進治療耐藥性，在NSCLC 的發生、侵襲和轉移過程中起到作用[3]。微小核糖核酸（micro RNA，miRNAs）參與調控腫瘤細胞增殖、侵襲和免疫逃逸等生物學過程，可通過調節免疫細胞功能影響TIME，進而影響腫瘤進展[4]。miR-873 是腫瘤診斷和預后的分子標志物，已被證實可通過調控其靶基因表達參與癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程，與肝細胞癌、結直腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤密切相關[5]。miR-138-5p 在胰腺癌、鼻咽癌、乳腺癌等多種癌癥中被發現充當腫瘤抑制基因，miR-138-5p 表達缺失與癌細胞增殖、侵襲和癌癥不良預后有關[6]。miR-873 和miR-138-5p 在NSCLC 的報道十分少見，其在NSCLC 的表達特點以及臨床意義尚不清楚，鑒于此本研究擬探討血清miR-873 和miR-138-5p 表達與NSCLC 患者免疫微環境以及預后的關系，以期為臨床NSCLC 治療和預后分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2019年2月～2021年2月重慶醫科大學附屬巴南醫院收治的108 例NSCLC患者（NSCLC 組），男性65 例，女性43 例；年齡≥60 歲60 例，＜60 歲48 例；腫瘤直徑≥3cm 57例，＜3cm 51 例；病理類型：鱗癌82 例，腺癌26例；分化程度：低中度分化72 例，高度分化36 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期59 例，Ⅲ～Ⅳ期49 例。納入標準：①經穿刺活檢或手術獲得組織標本，病理學證實為NSCLC；②入組前未接受任何形式的化療、放療或靶向藥物治療；③有完整的臨床資料；④標本的采集和處理符合臨床試驗的倫理規范和操作規程。排除標準：①其它部位原發惡性腫瘤；②血液腫瘤、血液疾病和免疫系統疾病。另選擇同期于我院門診體檢中心體檢的65 例健康志愿者為對照組，男性39 例，女性26 例，年齡≥60 歲42 例，＜60 歲23 例，兩組性別和年齡分布比較差異無統計學意義（P＞0.05），本研究已經獲得我院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑 miRNeasy Serum/Plasma Kit 試劑（德國QIAGEN 公司）；Primer Script RT 試劑盒，SYBR Green PCR Kit（日本Takara 公司）；Veriti PCR 儀（美國賽默飛公司）；Vectra 全自動定量病理成像分析系統（美國PerkinElmer）。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測miR-873，miR-138-5p 表達：所有患者入組次日清晨（對照組體檢當日）采集靜脈血3ml 注入干燥試管，待血液凝固后離心（相對離心力3 024×g，時間5min）獲得血清，-80℃保存。取血清樣本，miRNeasy Serum/Plasma Kit 試劑提取總RNA，使用Primer Script RT 試劑盒將總RNA 反轉錄為cDNA。SYBR Green PCR Kit 和Veriti PCR 儀進行qRT-PCR。反應條件：95℃初始變性5 min，95℃ 20s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35 個循環，72℃最終延伸5 min。反應體系：SYBR?Premix Ex Taq? II（2×）12.5μl，dNTP1.6μl，Taq DNA 聚合酶1μl，上下游引物10μmol/L 各1μl，加反應緩沖液至25μl。引物序列：miR-873 的正向引物為5’-GGGGCAGGAACTT GTG AG-3’，反向引物為5’-GTGTGGTGTGGTATG GTGTG-3’。miR-138-5p 的正向引物為：5’-CTAGA GCTCAACTGAAGTGGCTAAACTG-3’，反向引物為5’-GCTAGGCGTTGAAGTTCTGCCTAAATGC-3’。β-actin（內參），上游：5’-TGCGTGACATTAAG GAGAA-3’，下游：5’-AAGGAA GGCTGGAAGAG T-3’。2-ΔΔCt計算miR-873和miR-138-5p相對表達量。

1.3.2 多重免疫熒光染色法檢測TIME 指標：取肺癌組織石蠟標本，經脫蠟、水化，10 mmol/L 枸椽酸鈉緩沖液孵育10 min，微波20 min，0.3g/dl H2O2處理抑制內源性過氧化物酶活性，5g/dl 脫脂奶粉孵育阻斷非特異性結合，PBS 洗滌。加入一抗、二抗孵育、漂洗。多重免疫組織化學試劑盒進行熒光標記，DAPI 染料復染、封片，全自動定量病理成像分析系統進行分析，1+，2+，3+表示陽性程度，1+弱陽性，2+中等程度陽性，3+強陽性，采用組織化學評分（H 值）分析TIME 中CD3，CD4，CD8，CD68 和CD163，叉頭狀轉錄因子3（forked head transcription factor 3，FOXP3）、淋巴細胞活化基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG3）、T 細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（T-cell immunoglobulin mucin molecule 3，TIM3）、程序性細胞死亡受體1（programmed cell death receptor 1，PD-1）和程序性細胞死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）的蛋白表達情況，H 值=[（3+）%×3+（2+）%×2+（1+）%×1]×100[7]。

1.3.3 隨訪：NSCLC 患者出院后定期電話隨訪和門診復查，隨訪截止2022年6月。記錄隨訪期間NSCLC 患者生存情況?？偵妫╫verall survival，OS）時間定義為自術后至全因死亡或隨訪截止時間。

1.4 統計學分析 SPSS 25.00 進行數據錄入和分析，經K-S 法檢驗miR-873,miR-138-5p 和TIME指標符合正態分布以(±s)表示，采用student-t檢驗。Pearson 分析血清miR-873,miR-138-5p 表達與TIME 指標的相關性。Kaplan-Meier 法繪制不同miR-873 和miR-138-5p 表達下NSCLC 患者生存曲線，Log-Rank 檢驗生存率的差異。COX 比例風險回歸模型分析影響NSCLC 患者預后的危險因素。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 NSCLC 組和對照組血清miR 873,miR 138 5p 表達比較 見表1。NSCLC 組血清miR-873 和miR-138-5p 表達低于對照組，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

表1 NSCLC 組和對照組血清miR-873,miR-138-5p表達比較（±s）

表1 NSCLC 組和對照組血清miR-873,miR-138-5p表達比較（±s）

指標NSCLC 組（n=108）對照組（n=65）t 值P 值miR-873（2-ΔΔCt）1.02±0.23 3.15±0.82-25.426 0.001 miR-138-5p（2-ΔΔCt） 1.21±0.26 3.54±0.92-24.769 0.001

2.2 NSCLC 血清miR-873,miR-138-5p 表達與患者臨床病理特征的關系 見表2。TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低中度分化患者血清miR-873 和miR-138-5p表達低于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、高度分化患者（均P＜0.05），不同性別、年齡分布、病理類型、腫瘤直徑之間血清miR-873 和miR-138-5p 表達比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

表2 不同NSCLC 臨床病理特征患者血清miR-873,miR-138-5p 表達比較(±s)

表2 不同NSCLC 臨床病理特征患者血清miR-873,miR-138-5p 表達比較(±s)

類 別nmiR-873（2-ΔΔCt）tPmiR-138-5p（2-ΔΔCt）tP性別男650.99±0.25 1.19±0.30 0.9490.345女431.07±0.161.24±0.21 1.8600.066年齡（歲）≥60601.00±0.26 1.18±0.31 1.1320.260 1.3880.168＜60481.05±0.181.25±0.18腫瘤直徑（cm）≥3570.98±0.25 1.9220.057 1.17±0.25 1.9550.053＜3511.06±0.171.25±0.16病理類型鱗癌821.01±0.23 1.20±0.21 0.8270.410腺癌261.05±0.201.24±0.23 0.7960.428分化程度高度分化361.15±0.09 1.32±0.10 9.6150.001 6.8890.001低中度分化720.96±0.101.16±0.12 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期591.10±0.11 10.2530.001 1.26±0.16 3.3610.001ⅢA 期490.92±0.061.15±0.18

2.3 miR-873，miR-138-5p 表達與TIME 指標的相關性 見表3。NSCLC 患者CD3，CD4，CD8，CD68，CD163，FOXP3，LAG3，TIM3，PD-1 和PD-L1 的H值分別為5.21，4.02，13.02，2.02，1.32，1.16，3.35，16.02，17.43 和15.32。血清miR-873和miR-138-5p 表達與PD-1，PD-L1，CD4，CD8 的H值呈負相關（均P＜0.05），與CD3，CD68，CD163，FOXP3，LAG3 和TIM3 的H值無相關性（均P＞0.05）。

表3 miR-873，miR-138-5p 表達與TIME 指標的相關性

2.4 不同miR-873,miR-138-5p 表達NSCLC 患者生存比較 中位隨訪21（4～40）月，108 例患者中失訪5 例，余103 例患者在隨訪期間死亡56例，繪制Kaplan-Meier 生存曲線，低表達miR-873（＜1.02，n=52）和低表達miR-138-5p（＜1.21，n=53）NSCLC 患者OS 生存率為34.62%（18/52），32.08%（17/53），低于高表達miR-873（≥1.02，n=51） 和高表達miR-138-5p（ ≥1.21，n=50）NSCLC 患者的56.86%（29/51），60.00%（30/50），差異有統計學意義（Log-Rankχ2=4.724，5.607，均P＜0.05），見圖1。

圖1 不同miR-873，miR-138-5p 表達NSCLC 患者生存曲線

2.5 影響NSCLC 生存的因素分析 見表4。以NSCLC 患者生存情況為因變量（0=存活，1=死亡），納入年齡（賦值：0=＜60 歲，1=≥60 歲），性別（賦值：0=女，1=男），腫瘤直徑（賦值：0=＜3cm，1=≥3cm），病理類型（賦值：0=鱗癌，1=腺癌），分化程度（賦值：0=高度分化，1=低中度分化），TNM 分期（賦值：0=Ⅰ～Ⅱ期，1=Ⅲ～Ⅳ期），miR-873（賦值：0=高表達，1=低表達），miR-138-5p（賦值：0=高表達，1=低表達）為自變量。單因素COX比例風險回歸分析結果顯示分化程度、TNM 分期、miR-873,miR-138-5p 與NSCLC 患者預后有關（P＜0.05）。多因素COX 比例風險回歸模型（向后逐步法篩選變量），結果顯示TNM分期Ⅲ～Ⅳ期是NSCLC 患者不良預后的危險因素（P＜0.05），miR-873 和miR-138-5p 是保護因素（P＜0.05）。

表4 影響NSCLC 生存的單因素和多因素COX 比例風險回歸

3 討論

研究顯示腫瘤往往與其賴以生存的微環境相依相行，腫瘤免疫微環境（TIME）是一個極其復雜的系統，包括細胞和非細胞成分，如血管、成纖維細胞、免疫細胞、骨髓來源的炎癥細胞、信號化學物質和細胞外基質（extracellular matrix，ECM），上述細胞和非細胞成分均可與腫瘤細胞相互作用，促使惡性細胞表型和行為，如增殖、侵襲、上皮間充質轉化、血管生成和耐藥等，并影響免疫治療應答，與腫瘤進展和預后密切相關[8-9]。TIME 中含有大量的免疫細胞，部分具有抑癌作用，比如CD8+T 細胞和自然殺傷細胞，部分抑制免疫功能發揮促瘤作用，如調節性T 細胞和髓源性抑制細胞。miRNAs 是一種小型非編碼RNA，能通過抑制信使RNA 翻譯或促進信使RNA 降解在轉錄后水平調節基因表達，包括癌癥、心血管和代謝疾病在內的無數生理過程和病理過程高度依賴于miRNAs 的調節，miRNAs 在TIME 腫瘤細胞與其周圍免疫細胞相互作用過程中發揮關鍵作用，miRNA 可控制腫瘤細胞產生趨化因子或細胞因子，影響免疫細胞的遷移和擴張，直接調節TIME的成分，促進效應功能、抗原呈遞、表型極化和不同程度的免疫抑制，還可通過外泌體運輸到免疫細胞，影響免疫微環境[10]。

miR-873 位于染色體9p21.1 上，包括miR-873-5p 和miR-873-3p 兩個主要成員，miR-873 具有多種靶基因以及獨特的催化活性、轉錄調控、結合等分子功能，miR-873 可通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、Wnt/β-Catenin，核因子-κβ 和絲裂原細胞外信號調節激酶/細胞外信號調節激酶等信號通路，參與癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、細胞周期、細胞干性和化療反應等過程，影響癌癥發展[11]。研究顯示miR-873 在胃癌中表達下調，通過靶向含THUMP結構域蛋白1 抑制胃癌細胞增殖、侵襲，并促使化療敏感[12]。在結腸癌發病機制中，miR-873 通過靶向調節腫瘤抑制候選基因3，抑制癌細胞的增殖、集落形成和侵襲，抑制癌細胞轉移[13]。miR-873-5p在乳頭狀甲狀腺癌組織和細胞系中表達下調，通過靶向CXC 趨化因子配體16 抑制p65 和Rel-B 磷酸化，降低基質金屬蛋白酶1，9 和13mRNA 和蛋白表達，抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，發揮抑瘤作用[14]。本研究發現NSCLC 患者血清miR-873 表達降低，且與高TNM 分期、中低分化程度、不良預后有關。研究顯示miR-873 可能通過調節叉頭框蛋白M1 抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲，并增加癌細胞凋亡[15]。進一步分析miR-873 與TIME指標PD-1，PD-L1，CD4，CD8 的H值呈負相關，表明miR-873 可能參與TIME 調控過程，抑制NSCLC 進展。分析原因：首先，miR-873 通過直接結合PD-L1 的3’-未翻譯區抑制PD-L1 的表達以及PD-L1 下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號通路，減弱乳腺癌細胞的干性和化療耐藥性[16]；其次，單核細胞通過誘導腫瘤細胞毒性，抑制轉移，吞噬腫瘤物質和負調控Treg細胞，能夠抑制腫瘤的進展，靜息樹突狀細胞（又稱未成熟樹突狀細胞）能有效地捕獲抗原，通過調節T 細胞的活化，參與維持自我耐受性，抑制肺癌進展[17]，miR-873 可能通過降低單核細胞和靜息樹突狀細胞相對比例參與TIME調控過程，抑制NSCLC 進展[18]。因此miR-873 表達降低，其抑癌作用減弱，導致NSCLC 惡性進展和不良預后的發生。

miR-138-5p 在多癌癥類型表達下調，被稱為腫瘤抑制因子，現有報道顯示miR-138-5p 通過外泌體從乳腺癌細胞傳遞到腫瘤相關巨噬細胞，下調賴氨酸特異性去甲基化酶6B 的表達，抑制巨噬細胞M1 極化，刺激M2 極化，抑制腫瘤進展[19]。miR-138-5p 通過抑制靶向叉頭盒C1 表達，抑制前列腺癌細胞增殖、集落形成、細胞遷移和侵襲，發揮腫瘤抑制基因作用[20]。miR-138-5p 還可通過靶向抑制DEK 表達，抑制胃癌細胞增殖和腫瘤生長[21]。miR-138-5p 在膠質瘤中下調，miR-138-5p 過表達可通過靶向抑制其靶基因高遷移率盒蛋白13，下調脊椎蛋白2 的表達，抑制膠質瘤血管生成[22]。本研究發現NSCLC 患者血清miR-138-5p 表達下調，且與高TNM 分期、中低分化程度、NSCLC 患者低生存率有關。分析miR-138-5p 參與NSCLC 的機制為：miR-138-5p 可能通過靶向smad 核相互作用蛋白1抑制肺癌細胞增殖和遷移[23]，miR-138-5p 可直接結合到CDK8 的3’未翻譯區抑制細胞周期G0/G1 期阻滯，減緩癌細胞生長，增加癌細胞凋亡[24]。本研究發現miR-138-5p 與TIME 指標PD-1，PD-L1，CD4，CD8 的H值呈負相關，miR-138-5p 可能還參與NSCLC 的免疫應答，與TIME 有關。miR-138-5p 作為一種靶向PD-L1 的強腫瘤抑制因子[25]，可直接下調樹突細胞和T 細胞上PD-L1 和PD-1 的表達，激活免疫系統，降低腫瘤細胞中Ki67 和微小染色體維持蛋白2 的表達，抑制腫瘤生長[26]?？梢妋iR-138-5p 在NSCLC 發病機制中發揮抑癌基因作用，miR-138-5p 低表達可能促使NSCLC 惡性進展，與不良預后有關。

綜上，NSCLC 患者血清miR-873 和miR-138-5p 表達均較健康對照組下調，miR-873 和miR-138-5p 表達缺失與NSCLC 惡性病理特征以及低生存率有關。miR-873 和miR-138-5p 可能通過調控TIME參與NSCLC 發病過程。本研究創新性地為證實miR-873，miR-138-5p 與NSCLC 病理特征、TIME以及預后的關系，為NSCLC 臨床治療提供了新的靶點，為預后分析提供了新的標志物。不足之處在于尚不能直接證實miR-873，miR-138-5p 與TIME的關系，仍需開展體外細胞培養或構建動物模型來進一步探討。