基于生物信息學構建膀胱尿路上皮癌的ceRNA網絡以及關鍵mRNA與免疫功能分析

邵 波，汪 進，萬 水，吳開秀，田 申，杜沂宸，陳丹霞，馬園園（.安徽中醫藥大學附屬蕪湖市中醫醫院專業學位碩士研究生培養基地，安徽蕪湖 2400；2.安徽中醫藥高等?？茖W校附屬醫院/蕪湖市中醫醫院a.泌尿外科；b.皮膚科；c.肛腸科，安徽蕪湖 2400；.昆明醫科大學海源學院，昆明 65006）

膀胱癌是以間歇性、全程性、無痛性肉眼血尿為特征的泌尿系惡性腫瘤，常伴尿頻、尿急、尿痛等下尿路刺激癥狀。據統計，其病理分型80%以上屬膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)，且發病率、死亡率均逐年上升[1]，嚴重威脅著中老年人群的身心健康。BLCA 發病機制復雜，與遺傳、基因、生活等因素密切相關，目前其僅能通過癥狀及影像學對已發生癌性組織學改變者進行初步診斷，而對無組織學改變的癌前狀態的高風險患者卻無明確檢測手段，且對明確診斷者除手術外無其他有效治療手段。因此，BLCA 診斷物的挖掘、病變過程中關鍵基因的鑒定以及針對基因的免疫治療是需要重點解決的問題。近年來基因組學的發展和芯片檢測的廣泛應用積累了海量的表達譜數據，而生物信息學分析能挖掘出疾病的關鍵靶點。因此，本研究設計采用生物信息學的方法，篩選BLCA 的關鍵信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)、微小核糖核酸（micro RNA，miRNA）及長鏈非編碼核糖核酸（long noncoding RNA，LncRNA），并針對mRNA 探究其與免疫功能的相關性，以期尋找可以預測和治療BLAC 的生物學靶點及免疫治療方向，為BLAC 進展的調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 資料來源 UCSC Xena 數據庫(https://xena.ucsc.edu)下載404 例BLCA 患者及28 例正常人的mRNA 表達數據和臨床數據用于mRNA 篩選，GEPIA 數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)的702 例腫瘤患者及103 例正常人的基因表達量數據用于關鍵mRNA 的驗證，miRNA 和LncRNA 表達數據通過TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov)下載，免疫數據來源于TIMER 2.0 數據庫(http://timer.cistrome.org/)。研究資料來源于公開的科研數據庫，無需醫學倫理學審查。

1.2 內源競爭性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)網絡關鍵基因篩選

1.2.1 篩選關鍵mRNA：使用R 軟件，設置參數“|logFC|＞1”且“fdr ＜0.05”對正常人和腫瘤患者進行mRNA 表達量的差異分析，篩選關鍵mRNA，設置參數“KM-Pvalue＜0.05”且“Cox-Pvalue＜0.05”且“HR ＞1”對關鍵mRNA 的高低表達組進行生存差異分析，將GEPIA 數據庫數據以相同方式進行生存差異分析驗證關鍵mRNA。

1.2.2 篩選關鍵miRNA：于ENCORI 數據庫中，設置參數“Human”且“programNum ≥2”且“target=關鍵mRNA”，查找與關鍵mRNA 相結合的所有miRNA。使用R軟件，設置參數“Cor＜-0.2”且“Pvalue＜0.05”進行關鍵mRNA 與所有miRNA 的共表達分析以篩選關鍵miRNA，關鍵miRNA 高低表達組的生存差異分析參數設置與關鍵mRNA 一致。

1.2.3 篩選關鍵LncRNA：于ENCORI 數據庫中，設置參數“miRNA=關鍵miRNA”且“target=all”，篩選出與關鍵miRNA 具有靶向關系的所有LncRNA。使用R 軟件，設置參數“Cor ＜0”且“logFC ＞0”且“Pvalue ＜0.05”進行miRAN 與LncRNA 的共表達分析以篩選關鍵LncRNA，關鍵LncRNA 高低表達組的生存差異分析參數設置與關鍵mRNA 一致。

1.3 ceRNA 網絡構建 根據ceRNA 的假設，miRNA 結合mRNA 使其沉默，LncRNA 可以通過競爭性結合miRNA 來影響基因沉默而充當mRNA的協同基因，因此miRNA 與LncRNA 之間存在反比關系，而mRNA 與LncRNA 之間為正相關關系。以此為基礎，將篩選出的關鍵mRNA，miRNA 和LncRNA 用于構建ceRNA 調控網絡。

1.4 關鍵mRNA 與免疫功能分析 通過TIMER 2.0數據庫分析關鍵mRNA 表達量與免疫細胞含量及免疫檢查點(CD274，PDCD1，CTLA4)的相關度，R 軟件包分析關鍵mRNA 與上述免疫細胞的免疫細胞標記基因（immunomarker genes,IG）的相關度，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 關鍵mRAN 的篩選和分析結果 篩選出BLCA 的保護性基因共5 個，高風險基因共17 個，其中相關度最高的高風險基因為脯氨酸3-羥化酶家族成員4(proline 3-hydroxylase 4，P3H4)，該基因在腫瘤患者中呈高表達，表達量越高，生存時間越短，見圖1，圖2。GEPIA 數據庫驗證顯示，P3H4高低表達組之間的生存率比較差異具有統計學意義(P=1.2e-09 ＜0.05)，與圖2 結果一致，表明P3H4可作為高風險基因進行下一步研究。

圖1 mRNA 腫瘤患者與正常人表達量差異分析圖

圖2 mRNA 高低表達組的生存分析圖

2.2 關鍵miRAN 的篩選和分析結果 ENCORI 數據庫篩選出與P3H4 相結合的miRNA 共33 個。共表達分析篩選出關鍵miRNA 為hsa-miR-151a-3p，該基因在腫瘤患者中表達量顯著低于正?；颊?，見圖3，圖4。高低表達組生存分析提示，hsa-miR-151a-3p 高表達的患者生存時間更長，上述分析差異具有統計學意義(均P＜0.05）。

圖3 P3H4 與hsa-miR-151a-3p 表達量相關性圖

圖4 hsa-miR-151a-3p 腫瘤患者與正常人的表達量差異圖

2.3 關鍵LncRAN 的篩選和分析結果 ENCORI 數據庫篩選出與關鍵miRNA 結合的LncRNA 共14 個，共表達分析篩選出關鍵LncRNA 為MIR100HG，該基因與P3H4 呈正相關，見圖5。與hsa-miR-151a-3p 呈負相關，見圖6。MIR100HG 高表達時BLCA患者生存率高，見圖7。上述分析差異具有統計學意義(均P＜0.001）。

圖5 MIR100HG 與P3H4 表達量的相關性圖

圖6 MIR100HG 與hsa-miR-151a-3p表達量的相關性圖

圖7 MIR100HG 高低表達組生存時間差異圖

2.4 ceRNA 網絡構建 見圖8。根據上述篩選結果及ceRNA 理論的假設，我們構建了一個mRNAmiRNA-LncRNA 的三重調控網絡。

圖8 ceRNA 調控網絡示意圖

2.5 mRNA 與免疫功能分析 見表1。相關度分析顯示，P3H4 表達量與CD8+T 細胞、腫瘤相關性中性粒細胞(tumor-associated neutrophil，TAN）、腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)和樹突狀細胞(dendritic cell，DC)含量呈正相關。R 軟件篩選出IG 共15 個，其中14 個與P3H4 呈正相關，1 個呈負相關。免疫檢查點的分析中，P3H4 與CD274,PDCD1 和CTLA4 均呈正相關，差異具有統計學意義(均P＜0.01）。

表1 P3H4 與IG 表達量的相關度

3 討論

膀胱尿路上皮癌(BLCA)發病機制復雜，與包括基因在內的多種因素密切相關[2]。目前BLCA 的治療以手術、放化療為主，但其副作用大、復發率高。近年來，為了尋求更加有效、安全的診療方式，越來越多的學者開始從基因入手，力求實現癌前狀態檢測和免疫調控以達到診療目的，而內源競爭性RNA(ceRNA)[3]作為一種調控機制，在腫瘤發生發展和免疫治療中占有重要地位。通過生物信息學探究BLCA 的ceRNA 網絡機制，并分析關鍵mRNA與免疫功能的關系，為闡明其發病機制、癌前檢測及免疫治療提供一種新的思路。

3.1 ceRNA 調控網絡 本研究構建的ceRNA 調控網絡為(P3H4)-(hsa-miR-151a-3p)-(MIR100HG)。P3H4屬脯氨酰3-羥化酶（prolyl 3-hydroxylase,P3H）家族成員，有研究表明，P3H4 在泌尿系腫瘤中通常呈現高表達，其可促進自身抗原的形成，而泌尿系腫瘤的發生又與自身免疫破壞密切相關[4]，從而促進腫瘤的發生發展，這與本次研究相一致，提示了P3H4 成為BLCA 預后標志物的可能。hsamiR-151a-3p 屬于新型基因，目前對該基因的研究較少，其表達可能與多種腫瘤密切相關[5]，如高表達的miR-151a-3p 在肝癌、胰腺癌、肺癌等中作為致癌基因，而在乳腺癌中，其高表達時通過調控TWIST1 基因以限制腫瘤的發生發展。目前關于其對泌尿系腫瘤影響效果的報道較少，少數實驗表明，其通過負調控腫瘤高風險基因從而達到抑制腫瘤發生發展的作用[6]。MIR100H 是11 號染色體上miR-100，let-7a-2 和miR-125b-1 簇的宿主基因，有研究[7]結果顯示，MIR100H 基因可通過對HNRNPA2B1基因的下調從而抑制BLCA 的進展、轉移。本次研究結果提示，MIR100H 與高風險基因P3H4 的表達雖然存在協同關系，但其對患者生存的影響卻背道而馳。綜合分析結果推測，MIR100H 對BLCA 的發展可產生雙向調節作用，一方面作為ceRNA 網絡中的關鍵LncRNA，促進BLCA 的發生發展，另一方面又通過對HNRNPA2B1 等高風險基因的下調而充當保護性基因的角色，但總體對BLCA 患者的生存有益。

根據本次研究所得，生理情況下，hsa-miR-151a-3p 同時與P3H4 及MIR100HG 相結合以調控基因表達，當BLCA 發生時，hsa-miR-151a-3p 基因下調，降低了對高風險基因P3H4 的結合作用，同時MIR100HG 呈現高表達而進一步結合hsa-miR-151a-3p，使hsa-miR-151a-3p 對P3H4 的結合作用進一步降低，導致了BLCA 的發生發展。由此可得，治療BLCA 時，可考慮下調P3H4 表達，上調hsamiR-151a-3p，對于MIR100H，在上調其表達的同時需打斷其與hsa-miR-151a-3p 的結合過程，由此對BLCA 的治療可產生更好的效果。

3.2 免疫功能分析 本研究發現，P3H4 表達與TAN，DC，TAMs，CD8+T 細胞等免疫細胞含量及其相應IG 密切相關。

3.2.1 TAN 及其所屬IG 對BLCA 的作用分析：當前研究表明，TAN 對腫瘤細胞的調節作用是雙向的，一方面分泌活性氧、髓過氧化物酶等細胞毒介質產生細胞毒作用殺傷腫瘤細胞；另一方面，又合成釋放彈性蛋白酶[8]、生成的外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)[9]等方式促進腫瘤新生血管生成，介導參與腫瘤細胞增殖、侵襲和免疫耐受。本次研究結果中，標記基因ITGAM 與CCR7 呈現高表達，ITGAM[10]與ICAM-1 互作可介導NETs 形成，CCR7[11]可誘導TAN 向淋巴結的遷移，兩者均介導BLCA 腫瘤微環境TAN 的促腫瘤效應，而與腫瘤細胞殺傷作用相關的IG 表達量未見上調，由此得出TAN 在BLCA 腫瘤微環境中的作用是促進腫瘤發展、介導免疫耐受。有研究表明，TAN 絕對值低與免疫治療效果呈正相關，且腫瘤微環境中TAN 含量高，往往提示預后不良[12]，這與本研究所得結果一致。

3.2.2 DC 及其所屬IG 對BLCA 的作用分析：樹突狀細胞（dendritic cells，DC）是專職抗原遞呈細胞，分為經典樹突狀細胞（classical dendritic cells，cDC）和漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC），cDC 可激發T 細胞免疫應答并促進T 細胞依賴性抗體生成[13]，而腫瘤微環境中的pDC 由于功能失調，表達PD-L1 及端粒酶B直接抑制T 細胞應答，同時TNF-α 和IL-8 分泌增加促進血管生成等方式促進耐受和侵襲[14]。本研究得到高表達的IG 包括HLA-DPB1，HLA-DQB1，HLA-DRA，HLA-DPA1，ITGAX 和NRP1，前四者主要參與cDC 的抗原呈遞過程，可增強免疫殺傷效果，發揮抗腫瘤效應。但由于腫瘤微環境中pDC占主要地位，對pDC 發揮重要效應的高表達IG 為ITGAX 和NRP1，而ITGAX 的上調常導致IL-12，IL-23 和TNF-α 等在pDC 的表達而表現促腫瘤效應[15]，NRP1 在pDC 中的高表達效應亦是如此[16]。由此可見，DC 細胞在BLCA 腫瘤微環境中主要為pDC，且由于ITGAX 和NRP1 的高表達而具有促進腫瘤發生發展重要效應。

3.2.3 腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)及其所屬IG 對BLCA 的作用分析：TAMs 是腫瘤免疫治療的良好效應者。腫瘤微環境中各種因素的影響下，TAMs分化為抗腫瘤巨噬細胞(M1)和促腫瘤巨噬細胞(M2)兩種類型。M1 巨噬細胞代表“經典的”活化巨噬細胞，可發揮抗炎、抗腫瘤特性；M2 巨噬細胞則不僅抑制T 細胞攻擊腫瘤細胞，而且還可引起腫瘤細胞增殖和免疫逃逸[17]。結合我們在BLCA 腫瘤微環境中發現的可得，包括PTGS2[18]，CD163[19]，VSIG4[20]，MS4A4A[21]在內的四個TAMs相關的IG 呈現高表達，干擾素調節因子5(IRF5)則為低表達。前四者高表達可誘導TAMs 的M2 型極化，IRF5[22]則誘導TAMs 的M1 型極化。M2 型極化基因的高表達、M1 型極化基因的低表達，表明了BLCA 微環境中，TAMs 以M2 型為主，起著重要的促腫瘤效應。

3.2.4 CD8+T 細胞及其所屬IG 對BLCA 的作用分析：CD8+T 細胞介導人體特異性細胞免疫，可直接殺傷腫瘤細胞作用，延遲腫瘤的生長以及延長患者的生存期[23]。本研究所得CD8+T 細胞所屬IG 包括CD8B 和CD4，兩者均屬于T 細胞抗原受體(T cell receptor，TCR)的共受體。傳統觀念認為，幼稚T 細胞分別表達CD8 或CD4 基因而發展為成熟的CD8+T 細胞或CD4+T 細胞，CD8 與CD4 具有排斥性而僅能發展為單陽性T 細胞。但根據我們所得，發現在BLCA 患者腫瘤微環境中，CD8+T 細胞表面同時存在CD8B 和CD4 的高表達，推測CD8+T 細胞由于微環境中抗原刺激，激活了CD4 基因而轉化為雙陽性T 細胞。有研究[24]表明，雙陽性T 細胞在體外實驗中對腫瘤細胞較單陽性T 細胞有更強的殺傷能力，但其由單陽性轉化為雙陽性的機制暫未能闡述。由于雙陽性T 細胞目前暫未在腫瘤組織以外的地方發現，故其或許可成為腫瘤診斷的標志物，同時也可稱為免疫治療的新手段。

3.2.5 免疫檢查點對BLCA 作用機制：免疫檢查點是傳遞免疫負反饋抑制信號的分子，常常介導細胞的免疫耐受[26]。本次研究得出與P3H4 呈正相關的免疫檢查點有CD274，PDCD1，CTLA4。CD274又稱程序性死亡配體1，PDCD1 又稱為程序性死亡受體1，兩者屬于配受體關系，二者結合便可向T淋巴細胞傳遞負向調控信號，導致T 細胞進入休眠狀態[27]。CTLA4 分子[28]位于T 淋巴細胞表面，其可與免疫刺激分子CD28 競爭性結合配體B7，降低CD28 作用的同時向T 淋巴細胞傳遞抑制性免疫信號，導致腫瘤免疫耐受[29]。P3H4 可上調上述免疫檢查點的分子表達，提示P3H4 可能具有潛在的腫瘤免疫抑制功能，參與抗腫瘤免疫調節信號通路的負反饋調節，從而促進BLCA 的發生發展，且預后不良?；诿庖邫z查點特性，上述檢查點或可成為BLCA 免疫治療的靶點。

本文通過構建ceRNA 調控網絡闡述了BLCA的發病原理，同時分析了P3H4 與腫瘤微環境免疫機制的關系，為BLCA 的診斷、治療、預后提供了參考線索。但本次研究僅限于對海量數據的挖掘，雖具現實意義，但缺乏體外實驗證據，我們將進一步完善該項研究，以提高本研究的可靠性。