FTO介導m6A修飾的PRKD2調節SIRT1/HIF-1α通路抑制糖尿病腎病足細胞損傷的機制研究

李亞寧,李成乾（青島大學附屬醫院內分泌科，山東青島 264200）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病常見的微血管并發癥，也是世界終末期腎臟病的第二位原因[1]。目前常見治療方法如控制血糖或血壓，只能實現部分腎保護[2-3]。因此開發新的且有效的治療方法成為了DKD研究的首要任務。足細胞是終末分化的腎小球上皮細胞，在維持腎小球濾過屏障的完整性方面起著重要作用[4]。研究證實，足細胞功能障礙或損傷是DKD 發生發展的核心事件[5-6]。確定介導足細胞損傷的關鍵因素將為理解DKD 發病機制提供重要見解。有報道顯示，絲氨酸-蘇氨酸激酶蛋白激酶D2（serine-threonine kinase protein kinase D2，PRKD2）缺乏會促進胰島素抵抗和代謝紊亂，引發高胰島素血癥[7]。高胰島素血癥等異常的代謝綜合征會導致DKD 發生[8-9]。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）甲基化是真核生物mRNA 中普遍存在的修飾，m6A 修飾可以維持mRNA 的穩定性、轉運、剪接、定位、翻譯和蛋白RNA 相互作用[10-11]。據報道顯示，m6A 修飾可以調節炎癥和凋亡，是介導DKD 病理損傷的重要機制[6,12]。然而，PRKD2 和m6A 在DKD 發病中的生物學作用尚不清楚。本研究通過高糖誘導小鼠足細胞構建DKD 體外模型，分析了PRKD2 和m6A 去甲基化酶脂肪含量和肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）在高糖誘導的小鼠足細胞中的表達及其調控關系，探究FTO 介導的PRKD2 對DKD 進展的調控機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 小鼠足細胞（MPC5）購自中國醫學科學院基礎醫學研究所，在含10 g/dl 胎牛血清和20 U/ml 小鼠重組干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的RPMI 1640 培養液中于33℃下培養。

1.2 儀器與試劑 Magna RIP RNA 結合蛋白免疫沉淀試劑盒（17-701，Millipore Sigma）；Lipofectamine RNAiMAX試劑盒（13,778-030，Invitrogen Life Technologies）；Anti-β-actin 抗體（ab8226，Abcam）；Antim6A 抗體（ab284130，Abcam）；Anti-FTO（ab280081，Abcam）；Anti-SIRT1（ab110304，Abcam）；Anti-IgG（ab302644，Abcam）；Anti-HIF-1α（ab179483，Abcam）；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（Cysteinyl aspartate-specific proteinase-3，Caspase-3，G015-1-3），白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6，H007-1-2），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，H052-1-2）及單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1，H115） 檢測ELISA試劑盒（南京建成）；Trizol 試劑（Life Technologies，Carlsbad，CA）；ExoQuick exosome 提取試劑盒（System Biosciences，美國）；Prime Script RT 反轉錄試劑盒（Takara，中國大連）；miScript SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒（QIAGEN，德國）；RIPA 裂解緩沖液和BCA 蛋白測定試劑盒（Beyotime Institute of Biotechnology，上海）；ECL 化學發光試劑盒（Thermo Scientific，美國）；MK3 型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Multizoom AZ100型光學生物顯微鏡[尼康儀器（上海）有限公司]；Centrifuge5804R 型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Tanno 5200 型化學發光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；Spectra-Maxi3x型多功能酶標儀（美國MD 公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養：未分化的MPC5 細胞在含10 g/dl胎牛血清和20 U/ml 小鼠重組IFN-γ 的RPMI 1640培養液中33 ℃培養。誘導分化時，將足細胞在不含IFN-γ 的非允許條件下37 ℃維持7 天進行實驗。建立體外足細胞損傷模型時，將分化的足細胞在含1 g/dl 胎牛血清的培養液中饑餓12h，后接受35 mmol/L 葡萄糖進行高糖刺激24 h。

1.3.2 細胞轉染與分組：將高糖誘導后的MPC5 細胞分為control 組、空載體（vector）組及pcDNAPRKD2 組和pcDNA-FTO 組。按照分組，control組加入轉染試劑培養；vector 組采用空載體進行轉染；pcDNA-PRKD2 組采用PRKD2 過表達載體（pcDNA-PRKD2）進行轉染；pcDNA-FTO 組采用FTO 過表達載體（pcDNA-FTO）進行轉染；按照Lipofectamine RNAiMAX 試劑盒說明書將上述載體分別轉染到MPC5 細胞中。

1.3.3 RT-qPCR 實驗：使用Trizol 法提取總RNA，核酸定量后，采用Prime Script RT 試劑盒進行逆轉錄為cDNA，以此為模版配置PCR 反應體系，使用miScript SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒進行實時分析，條件：95℃ 1min，95℃ 20s，56℃ 10s 和72℃ 15s，32 個循環。引物序列：FTO-F：5’-TCACAG ACGTGGTTTCCGAG-3’，FTO-R：5’-ACCACTGGG TTGAGAGGA GT-3’；PRKD2-F：5’-AGAGCCAGG TAACAGGAACAATAG；PRKD2-R：GTGCTAAGGA GGGAGGCTCT-3’；β-actin-F：5’-CATCCGTAAA GACCTCTATGCCAAC-3’，β-actin-R：5’-ATGGAG CCACCGATCCACA-3’。β-actin 作為內參，通過2-ΔΔCt法計算相對表達水平。

1.3.4 Western blot 分析：用RIPA 裂解緩沖液裂解細胞，通過BCA 蛋白測定試劑盒測量蛋白濃度。將30 μg 蛋白在10g/dl 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)上分離，并轉移到PVDF 膜上。將膜在室溫下用5g/dl 脫脂乳封閉2h，加入Anti-FTO（ab280081，Abcam），Anti-SIRT1（ab110304，Abcam），Anti-HIF-1α（ab179483，Abcam）和Anti-β-actin 抗體（ab8226，Abcam），4℃孵育過夜。次日將膜與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 在室溫下孵育1h。β-actin 作為內參，通過化學發光（ECL）試劑盒對蛋白條帶進行可視化，并通過化學發光成像系統進行拍照。

1.3.5 m6A-MeRIP 分析：根據制造商說明，使用Magna RIP RNA 結合蛋白免疫沉淀試劑盒進行RIP。MPC5 細胞在用高糖處理之前用質粒轉染。將預先涂有5μg Anti-m6A 抗體或IgG 抗體的磁珠與細胞裂解物在4℃下孵育過夜。然后用蛋白酶K處理含有免疫沉淀的RNA-蛋白質復合物的磁珠以去除蛋白質。使用Trizol 提取RNA，并使用樣品進行mRNA 的m6A 免疫純化，以使用RT-qPCR 進行檢測。

1.3.6 ELISA 試劑盒檢測IL-6，TNF-α，MCP-1水平和Caspase-3 活性：按照試劑盒使用說明書，分別檢測細胞培養液中的IL-6，TNF-α，MCP-1水平以及Caspase-3 活性。

1.3.7 流式細胞術分析：通過膜聯蛋白V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。將細胞懸浮在膜聯蛋白V-FITC 和結合緩沖液的混合物中，室溫孵育30 min，然后加入PI 和結合緩沖溶液混勻，室溫溫育15 min。通過流式細胞儀檢測熒光，計算細胞凋亡率。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間差異比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 檢驗；兩組間差異比較采用Students-t檢驗；相關性分析用Pearson 法。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 高糖誘導的足細胞中FTO 和PRKD2 蛋白表達及相關性研究 Western blots 檢測顯示，與無高糖誘導對照組相比，高糖誘導的足細胞中FTO 蛋白（0.51±0.04 vs 1.00±0.03）和PRKD2蛋白（0.45±0.03 vs 1.01±0.04）水平顯著下調，差異具有統計學意義（t=13.17，16.76，均P＜0.001）。Pearson 相關性分析顯示，高糖誘導的足細胞中FTO 和PRKD2 蛋白水平呈正相關（r2=0.705 1，P＜0.001）。

2.2 FTO過表達轉染效率驗證 RT-qPCR檢測發現，pcDNA-FTO 組FTO mRNA 表達水平（3.21±0.15）較control 組（1.01±0.03）和vector 組（1.03±0.08）顯著升高，差異有統計學意義（F=8.35，P＜0.001），提示FTO 過表達細胞系構建成功。

2.3 FTO 對m6A 修飾的PRKD2 mRNA 表達的影響 MeRIP 分析結果顯示，與vector 組相比，pcDNA-FTO 組PRKD2 mRNA m6A 水平（1.01±0.13 vs 0.56±0.09）顯著降低，差異有統計學意義（t=51.37，P＜0.001）。RT-qPCR 結果顯示，pcDNAFTO 組PRKD2 mRNA 水平（3.16±0.14）較vector組（1.03±0.02）顯著升高，差異有統計學意義（t=11.82，P＜0.001）。提示過表達FTO 通過抑制PRKD2 mRNA 的m6A 修飾可上調PRKD2 表達。

2.4 RKD2 過表達轉染效率驗證 RT-qPCR 檢測顯示，pcDNA-PRKD2 組PRKD2 mRNA 表達水平（3.52±0.21）與control 組（1.03±0.05）和vector組（1.03±0.14）比較顯著升高，差異有統計學意義（F=47.13，P＜0.001），提示RKD2 過表達細胞系構建成功。

2.5 過表達PRKD2 對足細胞炎癥反應及細胞凋亡的影響 見表1。ELISA 法和流式細胞術檢測顯示，與control 組和vector 組比較，pcDNA-PRKD2 組炎癥因子IL-6，TNF-α，趨化因子MCP-1 分泌量、Caspase-3 活性及細胞凋亡率均顯著降低，差異具有統計學意義（F=2.35～79.13，均P＜0.01）。

表1 過表達PRKD2 對足細胞炎癥反應和細胞凋亡的影響（±s）

表1 過表達PRKD2 對足細胞炎癥反應和細胞凋亡的影響（±s）

項 目control 組vector 組pcDNA-PRKD2 組FP IL-6（pg/ml）512.76±61.85498.41±87.51301.86±21.857.51＜0.01 TNF-α（pg/ml）28.17±2.83 7.6926.35±5.4711.06±4.1210.47＜0.01 MCP-1（pg/ml）157.31±1165.52±16.8781.45±9.0361.97＜0.01 Caspase-3 活性（U/L）689.65±79.53715.91±113.58437.64±104.762.35＜0.01細胞凋亡（%）22.31±2.6921.07±3.288.41±3.1579.13＜0.01

2.6 過表達PRKD2 對SIRT1/HIF-1α 通路的影響Western blots 檢測顯示，與control 組（1.01±0.05，1.03±0.07）和vector 組（0.97±0.05，1.02±0.03）比較，pcDNA-PRKD2 組SIRT1 蛋白（3.51±0.15）水平顯著升高，HIF-1α 蛋白（0.37±0.07）水平顯著降低，差異具有統計學意義（F=31.54，8.31，均P＜0.01）。

3 討論

目前人們普遍認為進行性蛋白尿是DKD 最早的臨床特征之一[13]。尿液中清蛋白的存在與足細胞受損和腎小球濾過屏障破壞有關，這種情況稱為足細胞病[14]。系膜細胞和足細胞功能障礙會導致糖尿病腎病，足細胞損傷被認為是蛋白尿性腎臟疾病進展的最重要決定因素之一。與許多腎臟疾病一樣，DKD 的特征是出現蛋白尿，這是由足細胞凋亡和功能喪失誘導的，隨后是與腎小球硬化相關的腎小球濾過率降低[6]。足細胞在支持腎小球結構和功能以及形成濾過屏障方面發揮著重要作用，當足細胞受到葡萄糖或活性氧（read only storoge，ROS）等刺激時，會導致足細胞病中蛋白尿的發生[15-16]。葡萄糖通過誘導E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和β-鈣黏蛋白（β-cadherin）減少，間充質神經型鈣黏附蛋白(N-cadherin)的表達及肌成纖維細胞的形成，進而誘導足細胞損傷[15-16]。因此，足細胞耗竭已被作為建立蛋白尿新療法的新策略。

高血糖是糖尿病并發癥的主要因素，高糖誘導的腎臟缺氧是DKD 的常見途徑[6]。在1 型或2型糖尿病早期階段，長期強化血糖控制被認為是糖尿病并發癥的強有力的預防策略，尤其是對于DKD。然而，盡管強化血糖控制，約三分之一的糖尿病患者仍進展為DKD，這提出了“代謝記憶”現象。在負責“代謝記憶”的各種機制中，表觀遺傳修飾（主要包括甲基化修飾、組蛋白修飾和非編碼RNA 的表達）引起了更多關注?；趯Υx記憶現象的認識，m6A 甲基化修飾與表觀遺傳變化的相互作用可導致信號通路持續激活，從而促進DKD 腎臟炎癥、纖維化和腎小球肥大的發生。高血糖會增加缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的積累并破壞HIF-1α 的穩定性，通過多種機制導致足細胞損傷[17]。例如，Kang 等報道[18]，葡萄糖負載足細胞和糖尿病腎臟中HIF-1α 被誘導，高血糖引起的缺氧通過加速糖尿病足細胞的上皮間質轉換和肌成纖維細胞形成導致足細胞損傷?；谝陨蠄蟮?，本研究通過高糖誘導足細胞構建DKD 體外模型，探究m6A 去甲基化酶FTO 介導的PRKD2 對DKD 進展的調控機制。

m6A 修飾是真核生物mRNA 中最豐富的修飾[10]。m6A 修飾的作用包括維持mRNA 穩定性、運輸、剪接、定位、翻譯和蛋白質-RNA 相互作用。哺乳動物細胞中，m6A 修飾是動態且可逆的，m6A甲基轉移酶執行修飾反應，而m6A 去甲基酶則逆轉該修飾。特定的RNA 結合蛋白可以直接或間接結合m6A 基序，從而影響RNA 功能。m6A 調節劑的生物學功能與組織發育、細胞分化、晝夜節律和其他多種人類疾病相關，例如癌癥進展、糖尿病、神經發育障礙和缺血性心臟病[7,11,19]。此外，m6A修飾可以調節炎癥和細胞凋亡，這是介導DKD病理損傷的重要機制。LU 等人[20]的研究發現糖尿病腎病的小鼠腎臟中m6A RNA 水平升高，其甲基轉移酶14（methyltransferase 14，METTL14）表達上調；METTL14 通過促進m6A 修飾降解SIRT1 mRNA 來加重足細胞損傷，METTL14 敲低通過促進自噬，減輕體內和體外炎性細胞凋亡，對受損的足細胞產生保護作用。FTO 作為RNA 去甲基化酶，控制m6A 修飾以影響mRNA 的生物合成、衰變和翻譯[10,21]。大量研究已證實，FTO 調控miRNA 參與糖尿病并發癥的疾病進展，如SUN 等[22]研究發現，過表達FTO 導致m6A 水平降低，通過增加細胞因子信號轉導抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1） 蛋白表達，減輕炎癥反應和腎損傷，抑制DKD 進展。HU 等[23]研究顯示，FTO 介導的m6A 水平降低誘導LncRNA EST00000436340 表達上調，增強了ENST00000436340 與多嘧啶束結合蛋白1（polypyrimidine tract binding protein 1，PTBP1）的結合，進一步導致細胞骨架重排，造成足細胞損傷和DKD 進展。與已有報道相一致，本研究發現過表達FTO 通過介導PRKD2 mRNA 的m6A 修飾可抑制高糖誘導的足細胞炎癥反應和細胞凋亡，抑制DKD 進展。

PRKD 家族屬于鈣模塊依賴蛋白激酶超級家族，早期研究表明PRKD 亞型在胰腺的各種外分泌和內分泌細胞中具有不同的表達?，F有報道顯示，PRKD2通過調節糖代謝參與各種疾病的發病過程，PKD2 是促進膳食脂肪吸收的關鍵信號節點，其缺失、失活或抑制可改善高脂飲食誘導的肥胖和糖尿病[24]。XIAO 等[25]研究發現，PRKD2 缺乏會增加胰島素分泌，誘導肥胖和胰島素抵抗，導致代謝絮亂，引發高胰島素血癥。JIAO 等[7]報道顯示，PRKD2 在高脂飲食喂養的小鼠骨骼肌和棕櫚酸誘導的C2C12 細胞中表達下調。糖尿病、高胰島素血癥等異常的代謝綜合征會導致DKD 發生[8-9]?；谝陨蠄蟮啦聹y，PRKD2 可能是抑制DKD 進展的調節因子。本研究對此猜測進行了驗證，發現過表達PRKD2 能夠抑制高糖誘導的足細胞的炎癥反應和細胞凋亡，與早期報道相一致，證實PRKD2 對DKD 進展具有抑制作用。除此之外，JIAO 等[7]報道還顯示，PRKD2 在棕櫚酸誘導的C2C12 細胞中的表達受m6A 甲基化水平調控，這與本研究結果一致，FTO 通過降低m6A 修飾上調PRKD2 的表達。除此之外，沉默信號調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）/HIF-1α 通路被報道在足細胞相關疾病進展中扮演重要角色[26]，如LU 等[20]研究發現，在足細胞病中SIRT1 mRNA 顯著降低。CHANG 等[27]研究顯示，與非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠的足細胞中SIRT1 表達減少，調控SIRT1/HIF-1α通路能夠改善糖尿病小鼠腎臟足細胞損傷，減輕DKD。SUN 等[28]研究顯示，連接蛋白43（connexin 43，Cx43）通過調節SIRT1/HIF-1α 信號通路，抑制高血糖誘導的腎上皮間質轉化和腎小管間質纖維化。本研究發現，過表達PRKD2 可促進SIRT1 蛋白表達，降低HIF-1α 蛋白表達，說明PRKD2 調控SIRT1/HIF-1α 通路抑制高糖誘導的足細胞炎癥反應和細胞凋亡。但本研究還存在一定的局限性，首先只做了體外實驗，FTO 和PRKD2 在體內的調控機制還有待進一步驗證；其次PRKD2是否還通過其他途徑來調控DKD 的發生還需進行深入研究，以期為DKD 的治療提供更有價值的治療靶點，以及更可靠的實驗依據。

綜上所述，過表達FTO 通過抑制PRKD2 mRNA的m6A 修飾上調PRKD2 蛋白表達，通過SIRT1/HIF-1α 通路抑制高糖誘導的足細胞炎癥反應和細胞凋亡。