性狀鑒別聯合InDel標記檢測快速鑒定柑桔品種

劉小豐,王 洪,劉夢雨,朱世平,江 東,曹 立,余 歆

[1 西南大學柑桔研究所/國家柑桔工程技術研究中心,重慶,400712;2 西部(重慶)科學城種質創制大科學中心,重慶,401329]

我國是柑桔種植大國,柑桔種植面積超過300 萬hm2(4 500萬畝),產量超過4 600萬t(數據來自FAOSTAT,2021)。我國也是柑桔品種大國,當前在生產中栽種的柑桔品種超過100個,其中67個品種年產量超過1萬t,30個品種超過10萬t,6個品種和3個品種群超過100萬t[1]。隨著我國柑桔產業的快速發展,國內柑桔新品種選育熱度持續增加。自1997年10月1日實施《中華人民共和國植物新品種保護條例》以來,我國共頒布柑桔新品種保護申請公告208份,授權公告78份;自2017年5月1日開始實施《非主要農作物品種登記辦法》以來,已完成84個柑桔品種登記(數據來自中國種業大數據平臺)。與此同時,圍繞柑桔品種侵權、假冒等不法行為時有發生,如“中柑所5號”和“龍回紅臍橙”品種權侵權行政執法案分別列入2021和2023年度農業農村部農業植物新品種保護十大典型案例[2]。

基于形態特征的特異性(可區別性,Distinctness)、一致性(Uniformity)和穩定性(Stability)測試(簡稱DUS測試),通過品種性狀特征的描述和三性判斷來定義品種,是國際植物新品種保護聯盟(UPOV)授予品種權的依據[3]。自2016年1月1日實施的《中華人民共和國種子法》要求申請保護、審定和登記的品種應當具備DUS,并且明確DUS測試是植物品種管理的基本技術依據。因此,DUS測試是受到國際認可的、具備法律依據的植物品種定義方法。開展DUS測試需要將測試品種和近似品種相臨種植,為確保觀測到的性狀有足夠的一致性,通常需要進行至少兩個獨立的生長結果周期的測試[4-5]。柑桔是多年生木本作物,生長周期長,從嫁接到開花結果通常需要2～3年以上。同時,柑桔遺傳背景復雜,雜合度高,受環境影響較大,性狀表達一致性不及大田作物。在品種保護實踐中,品種權人通常希望在較短時間內判定品種是否受到侵權,但受采樣時間限制,往往難以采集到DUS測試所需的不同時期、不同部位的全部性狀,導致DUS測試在果樹品種權保護過程中執行困難。

分子標記是以核酸序列變異為基礎的遺傳標記,通過分子標記檢測可快速、準確、客觀、不受環境條件干擾地區分品種,在已知品種鑒定和遺傳多樣性分析中發揮著不可替代的作用[3]。在農作物研究中,基于簡單序列重復的SSR標記是最受歡迎的標記技術。近年來,隨著高通量測序技術的發展和普及,基于全基因組重測序數據得到的SNP標記和InDel標記,因密度大、多態性豐富、準確性高、位點明確等諸多優勢,成為新熱點[6-7]。特別是大片段(>30 bp)InDel標記,利用中濃度(1.5%～3%)瓊脂糖凝膠電泳就能很好地區分出差異性條帶,可方便、有效地應用于遺傳分析和品種鑒別。盡管分子標記在品種鑒定中應用前景廣泛,但它針對的是標準品種的符合性檢測,且很難成功鑒定部分芽變、回交、高世代分離選種等育種方式獲得的品種[3]。而芽變選種是仍然是當前柑桔新品種選育的重要方式,如溫州蜜柑、甜橙類品種群多為芽變產生[8],利用當前的分子標記技術難以辨別,僅依賴分子標記結果難以認定未知品種。

為了探索快速、可靠的柑桔品種鑒定方法,以5個未知柑桔品種為待測材料,進行了性狀鑒別聯合InDel標記檢測的鑒定研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

5個柑桔待測材料取自廣西壯族自治區靈川縣某果園。據業主反映,該批果苗按091無核沃柑(Citrus reticulataBlanco ‘091 Seedless Orah’)品種購進和種植,但其果實成熟后酸度明顯高于沃柑(C. reticulataBlanco ‘Orah’)和091無核沃柑,因此被認定為未知品種。在2023年4月上旬,隨機采集春梢及葉片、花和成熟果實作為鑒定材料,低溫冷藏送至實驗室。3個對照品種[愛媛28(C. reticulataBlanco ‘Ehime Kashi No.28’)、紅桔(C. tangerina)和紐荷爾臍橙(C. sinensisOsbeck ‘Newhall’)]和2個近似品種[091無核沃柑和無核金諾(C. reticulataBlanco ‘KinnowLS’)]的試驗材料同期采集自國家柑桔種質資源圃(重慶)。

1.2 試驗方法

1.2.1 性狀鑒別 從《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南 柑桔(NY/T 2435—2013)》所列113個測試性狀中選擇101個性狀(質量性狀20個,數量性狀62個,假質量性狀19個)對測試品種進行測試,其他12個性狀[樹姿、外種皮顏色、內種皮顏色、種子合點顏色、種子子葉顏色、種子胚性、花萼直徑、花瓣長度、花瓣寬度、花瓣指數、雄蕊數量和果實種子數量(人工自交授粉)]因未獲取而未進行測試。測試品種性狀測試完成后,先與國家柑桔種質資源圃(重慶)數據庫的品種性狀進行對比,獲得最為近似的品種,然后對近似品種采樣觀測相應性狀,比較測試品種與近似品種之間性狀的差異。

1.2.2 基因組DNA提取和PCR擴增 使用CATB法從柑桔葉片中提取基因組DNA[9]。取50 mg新鮮葉片,液氮研磨粉碎后加入700 μL CTAB抽提緩沖液,振蕩混勻后于65 ℃孵育30 min,中間顛倒混勻3～5次。氯仿-異戊醇(24∶1,體積比)抽提1～2次,上清液用0.7倍體積的異丙醇沉淀DNA,75%乙醇清洗2次后風干。DNA沉淀用100 μL ddH2O溶解,加入1 μL RNase A溶液(10 mg/mL,索萊寶),37 ℃孵育30 min去除RNA。Nanodrop 2000分光光度計(Thermo Scientific,美國)檢測DNA濃度和質量,當DNA濃度大于50 ng/μL且OD260/OD280和OD260/OD230在1.8～2.1時,方可用作PCR擴增模板。利用篩選的33個分布于9條柑桔染色體上的InDel分子標記(另文發表),對供試柑桔材料的DNA進行PCR擴增。反應體系為:2× Taq PCR Mix(NO. B639295,生工)10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 8.2 μL。反應程序為:95 ℃預變性180 s;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環;72 ℃ 120 s。PCR產物用含1/10 000 TS-GelRed(TSJ003,艾得萊)的1.5%瓊脂糖電泳分離,Quantum ST5凝膠成像系統(VILBER,法國)拍照記錄。

1.2.3 聚類分析 根據InDel標記擴增條帶電泳結果,在相同的遷移位置上,有帶的記為1,無帶的記為0,構建“0,1”矩陣。采用NTSYSpc2.10 e軟件計算品種間的遺傳相似系數,進行非加權組平均法(UPGMA)聚類分析,繪制樹狀圖[10]。

2 結果與分析

2.1 性狀鑒別

性狀鑒別結果顯示,5個測試品種在性狀上沒有明顯差異。其主要性狀特征為:春梢有刺,數量少,長度中,節間長度中;嫩葉無花青甙顯色,葉長度6.12～6.85 cm,葉寬度2.92～3.18 cm,葉形指數2.03～2.22,葉片呈闊披針形,葉尖端漸尖,有缺刻,葉基楔形,葉橫截面形狀中凹,扭曲程度中,葉背無茸毛,葉柄長度中,無翼葉;花無花青甙顯色,花瓣白色;果實縱徑4.10～4.43 cm,橫徑5.07～5.50 cm,果形指數0.80～0.83,單果質量59.26～72.40 g,果實最寬處在中部,果基、果頂稍圓,無凹陷,有放身狀溝紋,溝紋數量少、長度短,無果頸,無頸領,無果頂乳突,無花柱宿存,無果臍,果面呈黃橙色、無雜色,果面光澤中、光滑度中、無凹點,油胞凸、大小中、明顯度中,花柱痕直徑中,香氣弱;果皮厚0.28～0.30 cm,剝皮難易度中,韌度中,剝皮溢油量中,白皮層顏色為淺橙色,果肉顏色深橙色,無苦味,果心半充實,中心柱大小中,囊瓣整齊,囊瓣數10～11,分瓣難易度中,囊壁薄,汁胞緊實度中、長度短,果肉細嫩化渣,果汁含量中,可溶性固形物含量為15.7%～19.3%,果汁含酸量0.75%～0.86%,可食率高,種子數量1～2顆;一年開花一次,可單性結實,晚熟。

將以上性狀數據與國家柑桔種質資源圃(重慶)數據庫數據比對,發現測試品種與091無核沃柑和無核金諾最為相似。在101個比對性狀中,測試品種與091無核沃柑有4個差異性狀(序號為28、49、54和111的性狀),與無核金諾有1個差異性狀(序號為28的性狀)(見表1)。在差異性狀中,28和111號性狀為群體測量的數量性狀,49和54號性狀為群體觀察的假質量性狀,即測試品種與近似品種在質量性狀上無差異。盡管測試品種與091無核沃柑之間果實質量、果汁含酸量性狀表達代碼的差值均達2,但考慮到氣候條件、栽培技術等因素的不同,不宜直接斷定存在特異性(可區分性);同理,盡管測試品種與無核金諾之間僅在果實質量性狀上有差異且表達代碼的差值只有1,但不宜斷定兩者為同一品種。果實外觀見圖1。

圖1 5個測試品種與091無核沃柑和無核金諾果實外觀

表1 測試品種與近似品種差異性狀比較

2.2 InDel分子標記檢測

分別提取5個測試品種、2個近似品種及3個對照品種(愛媛28、紅桔和紐荷爾臍橙)的基因組DNA,用33個分布于9條染色體上的InDel標記檢測其多態性。結果表明,26個InDel標記在品種間展現出清晰的多態性(見圖2),11個InDel標記在測試品種和近似品種間具有多態性。在檢測和對照材料中,23個InDel標記有2條變異條帶,1個(I6_681)有1條變異條帶,2個(I5_597和I9_459)有3條變異條帶。5個測試品種間沒有位點差異,它們與性狀近似品種無核金諾無位點差異,與性狀近似品種091無核沃柑有12個位點的差異,與對照品種愛媛28有25個位點的差異,與對照品種紅桔有11個位點的差異,與對照品種紐荷爾臍橙有29個位點的差異?；贗nDel標記結果的UPGMA聚類樹顯示,測試材料與無核金諾聚在一起,它們與紅桔和091無核沃柑的遺傳距離較近,與愛媛28和紐荷爾臍橙的遺傳距離較遠(見圖3)。

注:1-5:測試品種1-5;6:091無核沃柑;7:無核金諾;8:愛媛28;9:紅桔;10:紐荷爾臍橙。

圖3 10份柑桔材料(5個測試品種、2個近似品種和3個對照品種)基于26個多態性InDel標記結果的UPGMA聚類

2.3 品種鑒定

結合性狀鑒別和InDel標記檢測結果,確認測試品種是無核金諾,不是091無核沃柑。

3 討論

沃柑是晚熟雜柑品種,具備高糖低酸、風味好、易剝皮、耐貯運等多種優勢,廣受市場歡迎。目前,全國沃柑種植面積已經超過13.3 萬hm2(200萬畝),僅南寧市武鳴區的種植面積就達3.3 萬hm2(50萬畝),產值150億元[11]。一般認為,沃柑由坦普爾桔橙(C. templeHort. ex. Y. Tanaka)和丹西紅桔(C. tangerinaHort. ex. Tanaka)雜交而來[12]。Barry等[13]利用柑桔褐斑病(alternaria brown spot)抗性鑒定和23對SSR標記分型后認為,沃柑的父本是金諾,而不是丹西紅桔。091無核沃柑是由沃柑輻射誘導而來的無核品種,在保留沃柑的眾多優點的同時,克服了沃柑多籽的缺點[14]。無核金諾是由金諾(C. reticulataBlanco)輻射誘導而來的無核突變,金諾由王柑(C. nobilisLour.)和地中海柳葉桔(C. reticulataBlanco)雜交而來。因此,無核金諾與091無核沃柑具有極高的相似性是有跡可循的。

盡管栽培、管理、氣候等因素對性狀的穩定性存在一定影響,但質量性狀和假質量性狀的穩定性比數量性狀高[15-16]。本研究通過性狀鑒別發現,測試品種在葉、花和果的97個性狀上與091無核沃柑相似,僅果實質量和果汁含酸量兩個數量性狀、果面顏色和油胞凹凸兩個假質量性狀上存在1～2個代碼值的差異,而與無核金諾之間僅在果實質量這個數量性狀上有差異。因此,通過性狀鑒別僅可以推斷091無核沃柑和無核金諾是測試品種的近似品種。

分子標記是品種遺傳多樣性分析和品種管理的有效工具。SSR標記被用于鑒定柑桔雜交品種[17, 18]和構建柑桔資源指紋圖譜庫[19],AFLP[10]、ISSR[20]、SRAP[21]、SNP[22, 23]、CAPS[24]等標記也被用于柑桔種質資源的分析。隨著深度測序技術的發展,大量柑桔基因組數據為InDel的可靠性和易檢測性提供了保證。Fang等[25]利用4個柑桔基因組開發了453適合于PCR檢測的InDel標記,其中適用于瓊脂糖凝膠電泳檢測的大片段(30～200 bp)標記占65%。楊程等[26]從柑桔葉綠體基因組中開發出4個InDel標記,它們在48個有代表性的柑桔屬及近緣材料中均能擴增出較為清晰的多態性條帶,表現出了極高的分辨能力。本研究的33個InDel標記來自雜柑品種基因組測試數據,其中26對引物在試驗品種間有多態性,并從兩個性狀極為相似的品種間檢測出12個位點的差異,表明此套InDel標記在柑桔品種鑒定中具有很好的便利性和鑒別能力。

分子標記技術在DUS測試中的應用越來越受到重視[27-29],實現分子距離和表型距離的強關聯是分子標記發展的方向。隨著測序技術的普及,SNP標記鑒定結果與與性狀鑒定結果表現了更好的相關性。Achard等[30]利用5 346個SNP和DUS性狀對322份大豆品種進行鑒定,確定品種間96%的SNP相似性代表了具有形態差異和不具有形態差異的分界線。Zhang等[31]利用40個經前期驗證過與性狀相關的SNP標記和50個DUS測試性狀分別對134個黃瓜品種進行鑒定,結果表明SNP標記和DUS測試性狀在品種區分水平上呈線性相關。目前,在DUS測試實踐中,分子鑒定標準仍以SSR標記為主[4,32-35],但SSR標記數量和鑒定能力有限,往往導致分子距離和表型距離相關性不高。本研究中,測試品種與近似品種091無核沃柑有12個位點的差異,而與對照品種紅桔只有11個位點的差異,可能是因為本套InDel標記未能與性狀關聯有關。因此,繼續開發與性狀關聯的InDel標記是未來研究的方向。

盡管分子標記技術發展迅速,但在品種保護中分子標記仍不能完全取代DUS測試[3]。如:柑桔芽變和誘變育種材料通過性狀鑒定十分容易,而分子標記鑒定卻十分困難。在中國已登記的84個柑桔品種中,芽變(46個)、輻射誘變(3個)、優良單株(10個)等難以采用分子標記進行鑒定的品種占71.95%。在柑桔芽變鑒定中,AFLP[36-38]和RAPD[39]分子標記技術是早期使用的方法,需要針對不同品種挖掘不同的引物,引物開發相當困難。近年來,胡冬梅等[40]利用Target SSR-seq技術成功鑒定了溫州蜜柑芽變,但該技術操作難度極高,在其他類型芽變(如甜橙)或誘導材料中的應用還有待進一步開發。這些分子標記技術針對的是已知來源的芽變品種的鑒定,對于未知或隱瞞來源的芽變品種來說,鑒定仍然相當困難的。因此,目前,在柑桔品種的鑒定中,分子標記作為DUS測試的輔助是具有一定優勢的,要實現品種確權,分子標記還需要與DUS測試相結合。

一直以來,缺乏快速準確的鑒定標準是新品種保護困難的重要原因[41]。DUS測試是品種確權的依據,但在柑桔中存在著DUS測試周期過長和近似品種確立困難等缺陷。本研究借助國家柑桔種質資源圃(重慶)超過1 900份柑桔種質資源及其性狀數據,通過DUS測試中的部分性狀觀測,結合分子標記技術檢測,實現了快速準確地鑒定柑桔品種,也為準確快速鑒定柑桔品種提供了解決有效方案。