福建黃果西番蓮果腐病菌分離鑒定及其生物學特性

林育釗,陳月莉,蔣璇靚,鄭金水,陳洪彬

(1 泉州師范學院海洋與食品學院,福建泉州,362000;2 福建省泉州市農業科學研究所,福建泉州,362212)

西番蓮PassifloracaeruleaL.,又稱百香果,是熱帶亞熱帶特色水果,在我國南方廣泛種植,主要分布在福建、廣西、廣東、臺灣等省(區)[1-4]。西番蓮果實含有多種營養物質,如酚類、氨基酸、糖類、酯類、醇類、礦物質等,具有較好營養價值,深受消費者喜愛[1,5-6]。目前,市場上黃果與紫果西番蓮果實銷售量較大,相比于紫果西番蓮果實,黃果西番蓮果實營養價值更高[7]。西番蓮果實采后常溫貯藏中易發生果皮失水皺縮現象,并伴隨果皮褐化和腐爛病斑,不利于果實采后貯藏保鮮,極大地縮短了果實貨架期[2-3,7-8]。莖基腐病、葉斑病、炭疽病、疫病、頂枯病等是西番蓮常見病害,對西番蓮產業造成嚴重危害[1,8-10]。近年來,我國廣西、廣東等地區西番蓮果實出現由可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae引起的果腐新型病害[11-12],即在侵染初期,發病部位出現淺褐色病斑,果皮凹陷;病害癥狀隨侵染進程而不斷擴大直至蔓延全果,導致果實腐爛[12]。筆者從福建省南安市種植的黃果西番蓮果實中也發現果腐病,發病癥狀與前人研究報道類似。Zhang等[11]從采后西番蓮果腐病果分離病原菌,并鑒定為L.theobromae,但未探究該病原菌生物學特性,也未提及發生果腐病的是黃果還是紫果果實,不利于黃果西番蓮采后果腐病防治。目前鮮見關于福建省黃果西番蓮果腐病菌的研究報道,因此本研究擬從病原菌分離鑒定等方面著手研究,以確定福建省黃果西番蓮果腐病菌,初步研究其生物學特性,以期為防治黃果西番蓮果腐病,穩定果實品質,推動產業健康發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

果實材料:采收福建省南安市溪美鎮宣化村緣味家庭農場“福建百香果3號”(PassifloracaeruleaL. cv. Fujian passion No. 3)黃金西番蓮九成熟果實,運回實驗室,挑取色澤均勻、大小和成熟度一致,無病蟲害,無損傷果實備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基,購于青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.2 果腐病菌分離和形態鑒定

1.2.1 分離和純化

參照陳蓬蓮等[13]的方法,采用組織分離法,對果腐病果果皮病健交界處用75%乙醇消毒,取邊長3 mm正方形組織塊,放于乙醇中浸泡30 s,隨后取出用無菌水清洗3次,無菌濾紙干燥,接種至含有鏈霉素100 μg/mL的PDA平板(直徑90 mm)上,放置于28 ℃條件下培養,當菌落直徑達到3 cm時,用無菌接種針取出邊緣菌絲轉接至新的PDA平板上,重復4次純化菌株,命名為B3。

1.2.2 致病性測定和形態鑒定

參照陳蓬蓮等[13]與Chen等[14]的方法,采用柯赫氏法則驗證菌株B3,將直徑5 mm 菌株B3菌絲塊接種到已經過酒精消毒、無菌水清洗、晾干處理的健康果實表面(損傷接種),以接種滅菌PDA培養基塊為對照,隨后裝袋于28 ℃條件下培養;待果實發病后,從病樣分離病原菌,與接種菌株對比;再把分離菌株接種于PDA平板上,28 ℃下培養,從菌株菌落特征、分生孢子形態等初步判定其種類。

1.3 分子生物學鑒定

1.3.1 菌株DNA提取

28 ℃下培養菌株B3至菌絲長滿整個PDA平板,用無菌藥勺取菌絲體,無菌水清洗3遍,無菌濾紙干燥,在液氮中研磨后移到1.5 mL離心管,采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株B3的基因組DNA。

1.3.2 菌株ITS區PCR擴增及測序

參照Jamali[15]的方法,使用真菌通用引物ITS-1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)、ITS-4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進行PCR擴增。目的產物片段純化、回收都使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒,最后由青島億信檢測技術服務有限公司完成產物測序。

1.3.3 序列比對與系統發育樹建立

在NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中,使用BLAST分析工具以獲得與菌株B3親緣性最接近的其他菌株的ITS序列,再使用MEGA 11.0軟件,采用鄰接法構建系統發育樹,用Bootstraps法(重復1 000次)檢驗。

1.4 病菌生物學特性測定

1.4.1 溫度的影響

參照張居念等[16]、陳南泉等[17]的方法,把菌株B3直徑5 mm菌絲塊(1.4.2—1.4.4同)接種在PDA平板上,分別放置在19、22、25、28、31和34 ℃下恒溫培養,相對濕度90%,48 h后采用十字交叉法測定菌落直徑(1.4.2—1.4.4同)。

1.4.2 pH值的影響

用1.0 mol/L HCl或NaOH調節滅菌的PDA培養基pH值,使得pH值分別達到4、5、6、7、8、9、10和11,把菌株B3菌絲塊分別接種在不同pH值PDA平板,相對濕度90%,28 ℃恒溫培養,48 h后測定菌落直徑。

1.4.3 碳源的影響

用Czapek固體培養基為基礎培養基,可溶性淀粉、D-果糖和葡萄糖等質量碳素替換其中的蔗糖,制成不同碳源培養基,不含蔗糖培養基為對照,把菌株B3菌絲塊接種至不同碳源培養基平板上,相對濕度90%,28 ℃恒溫培養,48 h后測定菌落直徑。

1.4.4 氮源的影響

以Czapek固體培養基作為基礎培養基,蛋白胨、硝酸鉀等質量氮素替換其中的硝酸鈉,制成不同氮源培養基,不含硝酸鈉培養基為對照,把菌株B3菌絲塊接種在不同碳源培養基平板上,相對濕度90%,28 ℃恒溫培養,48 h后測定菌落直徑。

1.5 數據處理

生物學特性測定均重復3次,結果以平均值±標準誤表示。采用軟件SPSS 22.0進行數據分析,用Duncan’s進行差異多重比較,p<0.01和p<0.05分別表示差異達極顯著或顯著水平。

2 結果與分析

2.1 西番蓮果實采后果腐病癥狀

由圖1可知,黃金西番蓮果實剛采收時,果皮黃綠色,采收果實25 ℃,相對濕度85%下貯藏,隨著貯藏時間延長,果實逐漸轉黃;貯藏12 d時,果實開始發生果腐病,果皮發病部位出現淺褐色斑點伴隨凹陷現象,有白色菌絲出現;隨著病害加劇發生,貯藏18 d,病斑顏色轉為黑褐色,且面積增大,灰白色菌絲增多,病斑周邊黃褐色變深,果皮變軟塌陷、腐爛、變薄,全果出現軟腐癥狀。

圖1 黃金西番蓮果實采后果腐病癥狀

2.2 果腐病菌致病性和形態鑒定

由圖2可知,健康黃金西番蓮果實果皮表面接種菌株B3菌絲塊后2 d,接種處出現淺褐色病圈;接種后3 d,接種處病圈擴大,呈黃褐色,出現凹陷現象,伴有白色菌絲;接種后5 d,接種處黑褐色,凹陷面積較大,果實褶皺,腐爛加劇,菌絲大量生長、呈灰白色,此時果實出現腐臭氣味。接種菌株B3的果實發病癥狀與果實自然發病癥狀一致。

圖2 黃金西番蓮果腐病菌致病性測定、PDA平板上培養形態和分生孢子

從接種菌株B3的果實再分離病原菌,接種在PDA平板上,其菌絲、菌落形態、分生孢子與自然病果分離所得菌株B3一致。菌株B3在PDA平板培養時,菌絲迅速生長,呈白色放射狀;2 d后基本長滿整個平板,氣生菌絲濃密,逐漸變為灰白色;培養7 d菌落較厚,菌絲灰黑色。顯微鏡下觀察菌株B3分生孢子為茶褐色單孢,球形或橢圓形,表面光滑,大小約(15.56～23.04) μm×(13.28～17.61) μm。根據菌株B3菌落、分生孢子等特征,初步判定為可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae。

2.3 果腐病菌分子生物學鑒定

用NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上BLAST工具搜索與菌株B3序列(登錄號為OQ087002)相似的rDNA-ITS序列,而后比對與分析發現,菌株B3與相關屬內參比菌株的rDNA-ITS序列的相似度為99%,推斷菌株B3是可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae(見圖3),與病菌形態鑒定一致。因此,分離獲得的菌株B3為可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae。

圖3 黃金西番蓮果腐病菌B3系統發育樹

2.4 病菌生物學特性

由表1可知,菌株B3在pH值4～11下均能生長。其中,pH值6時菌落直徑最大,為(82.07±1.84) mm,顯著(p<0.05)高于pH值4、7、10處理,極顯著(p<0.01)高于pH值5、8、9、11處理。說明菌株B3菌落生長最適宜pH值為6。

表1 不同培養條件對黃金西番蓮果腐病菌Lasiodiplodia theobromae菌落生長的影響

菌株B3菌落直徑在19～28 ℃下培養快速增大,28～34 ℃菌落直徑減小。28 ℃培養時,菌落生長速度最快,培養48 h菌落直徑為(89.32±0.66) mm,極顯著(p<0.01)高于19、22、34 ℃下培養的菌落直徑,顯著(p<0.05)高于25和31 ℃下培養的菌落直徑。說明28 ℃為菌株B3菌落生長最適溫度。

菌株B3在供試碳源培養基均能生長,其菌落直徑都大于對照(無碳源)。葡萄糖為碳源的培養基上,菌株B3菌落直徑最大,為(71.70±2.63) mm,極顯著(p<0.01)高于其他碳源培養基,說明葡萄糖為最適宜碳源。

菌株B3在供試氮源培養基均能生長,且菌落直徑均高于對照(無氮源)。其中,硝酸鉀為氮源培養基上,菌株B3菌落直徑最大,為(57.39±2.05) mm,極顯著(p<0.01)高于蛋白胨為氮源培養基,顯著(p<0.05)高于硝酸鈉為氮源培養基,說明硝酸鉀為最適氮源。

3 結論與討論

可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae是熱帶亞熱帶地區分布較為廣泛的病原菌,能夠導致多種植物病害,可引起植物根腐病[18-19]、流膠病[20]、葉斑病[21]等病害,進而導致植物腐爛。筆者從福建黃金西番蓮果腐病果分離純化病菌菌株B3,經過致病性測定、形態學與分子生物學鑒定為可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae,說明引起福建黃金西番蓮果實采后果腐病的病原菌為L.theobromae。與前人研究結果比較發現,L.theobromae引起的不同植物病害癥狀不一致。L.theobromae是導致桑和檳榔發生根腐病的主要病原菌[18-19],橡膠樹葉斑病可由L.theobromae侵染引起[21];張居念等[22-23]研究報道,龍眼果實采后焦腐病病原菌為L.theobromae。關于L.theobromae侵染源與侵染時期等仍需進一步研究。

對菌株B3L.theobromae的生物學特性初步研究發現,28 ℃、6、葡萄糖、硝酸鉀分別是其菌落生長最適溫度、pH值、碳源和氮源。與張居念等[23]報道的龍眼L.theobromae菌落生長最適溫度28～30 ℃,pH值6～7,最適碳源蔗糖和葡萄糖相似。西番蓮L.theobromae菌落生長最適pH值與劉樹森等[24]研究結果一致,最適溫度存在一定差異。西番蓮L.theobromae菌落生長最適碳源與戴利銘等報道一致,而最適pH值存在一定差異[21]。杜嬋娟等[25]對廣西西番蓮果腐病菌(L.theobromae)生物學特性研究發現,菌絲最適生長溫度、pH值、氮源分別是31～34 ℃、4.5～5.5、硫酸銨和氯化銨,與本研究結果不一致,存在較大差異。由此可知,不同區域西番蓮果實采后果腐病菌生物學特性存在差異,這可能與不同地區不同土壤栽培環境、氣候條件等有關,因而西番蓮果腐病防控應根據不同地區發生特點進行調整。本研究僅對L.theobromae部分生物學特性進行初步研究,仍需進一步研究其他生物學特性,以為防控黃金西番蓮果實采后果腐病提供有力理論支撐。