耐熱型西番蓮品種“欽蜜9號”花器官發育特征與繁育系統研究

廖 芬,黃永才,桂 杰,陳 格,蔣 萍,楊 柳

(廣西壯族自治區農業科學院/廣西作物遺傳改良生物技術重點實驗室,南寧,530007)

西番蓮又名百香果,是西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬(Passiflora)多年生常綠藤本植物,是熱帶特色優稀果樹,原產南美洲中北部,主要生長在中南美洲、澳洲、非洲及亞洲[1]。近年來,隨著我國消費者對西番蓮的認可,鮮食、加工市場對西番蓮的需求量急劇攀升,西番蓮種植面積不斷擴大,由于其生長期短(4～6個月),生產效益快,已成為我國熱區(省、市)扶貧和鄉村振興的重要果樹之一[2]?；ㄊ侵参镏匾敝称鞴?其發育進程和生物學特征影響授粉和結果。特別是花粉活力與壽命、柱頭可育性、花期相遇時間、雜交指數和異交傾向等都是植物有性繁殖過程的熱點問題[3]。近年來天氣異常,特別是高溫已成為西番蓮花芽敗育或花器官敗育的重要因素之一。研究西番蓮花器官發育進程及育性,對解析西番蓮耐熱性適應機制和推進抗熱雜交育種具有重要指導意義。近5年來,國內外西番蓮研究主要集中于抗病選育[4-5]、栽培條件優化[6-7]和品質分析等方面[8]。在耐熱性研究方面,主要針對花粉萌發進行相關研究。Hiroshi[9]等觀察了溫度對14個西番蓮雜交栽培品種花粉萌發的影響,結果發現不同品種花粉萌發的最適溫度不同,溫度范圍26～36 ℃,其中雜交種Minami-jujisei萌發最高溫度為36 ℃,Passiflora.laurifolia的萌發溫度最低,為26～28℃。紫果西番蓮(Passifloraedulis)在晝夜溫度33/28 ℃的高溫條件下會生產小而低糖的果實,夏季夜間高溫(30 ℃)還會對果皮的著色產生抑制作用[10]。田青蘭等[11]以“臺農1號”西番蓮為研究對象,發現花期前20～35 d、開花當天及花后5～20 d出現高溫(最高溫度和平均溫度分別高于36.19 ℃和26.24 ℃)會限制其花芽形成和著果。Atsushi等[12]比較不同溫度(30～40 ℃)對兩種日本栽培品種“Summer Queen”“Ruby Star”光合作用、蒸騰作用、呼吸率和葉綠體含量的影響發現,當溫度超過35 ℃時,2種西番蓮各生理指標參數隨溫度增加而下降,而高溫環境下“Ruby Star”比“Summer Queen”更穩定。

我們團隊分別于2019—2021年夏季高溫季節(8月)對西番蓮主產區,廣西玉林市、貴港市、欽州市、防城港市進行產業調查,發現主栽品種“臺農1號”“小黃金”“維蜜黃金”西番蓮在高溫季節(>35 ℃)著果率低于5%。針對當前國內缺乏耐高溫西番蓮品種問題,我們在大量收集國內外優異種質資源的基礎上,長期開展高溫脅迫(>35 ℃)條件下優異西番蓮種質資源篩選,于2020年選育出耐高溫、高產優質的黃金西番蓮(P.edulisf.flavicarpa)新品種“欽蜜9號”,該品種平均單果質量69.17 g,純甜無酸,糖酸比為12.7,可溶性固形物含量19.4%,不耐冷但耐高熱,在夏季>35 ℃高溫連續10 d以上仍可正常開花結果,而其他黃果西番蓮在此溫度條件下極少開花結果,說明該品種花器官發育可以耐受高溫。目前西番蓮適應高溫的花器官發育過程鮮見報道。本試驗觀察“欽蜜9號”花器官不同發育階段性狀,分析其花粉活力、柱頭可育性等,解析耐高溫品種繁育特點和耐熱機制,為創制耐熱型西番蓮雜交群體和新品系選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

耐熱型西番蓮品種“欽蜜9號”來自廣西壯族自治區農業科學院里建科學研究基地西番蓮資源圃,北緯23.20°,東經18.16°,海拔200 m,年日均最高氣溫17～37 ℃,日均低溫11～27 ℃,每年6—10月日均高溫33～37 ℃,年降水量1 100～1 300 mm,亞熱帶季風氣候。

試驗于2021—2022年7—10月開展,此期是“欽蜜9號”持續開花期,試驗地夏季35～37 ℃高溫主要集中在7—8月,2021年7—8月35 ℃ 以上高溫天氣共35 d,2022年7—8月共35 d;其中2021年7月12—22日持續11 d,2022年7月20日至8月4日持續16 d。9—10月仍有8～13 d 35 ℃ 以上高溫天氣(見圖1)。

圖1 2021—2022年7—10月供試果園溫度情況

在“欽蜜9號”二級蔓花序形成后,選取花序完整、植株健壯,生長良好無病株的枝蔓,標記不同發育階段花朵進行觀測和記錄;根據生長日期,采集不同發育階段花朵裝在密封袋中帶回實驗室,進行室內觀察和數據測定。

1.2 花器官特征測定

不同發育階段的花蕾表型測定:分別取不同發育階段花蕾20個,采用游標卡尺測定花蕾橫徑、縱徑,花蕾縱徑為萼筒基部到花冠頂部距離,花蕾橫徑為最寬位處的距離;將花蕾各部分分解,在立體解剖鏡下觀察花器官內部結構發育變化情況。

完全開放的花器官表型測定:采用游標卡尺測定完全打開后的花器官直徑,萼片直徑和長度,花瓣長度和寬度,萼筒直徑和高度,花藥柄長度,花藥長度和寬度,柱頭長度和寬度。

1.3 花粉數量測定

取裂蕾期前1～2 d花藥未裂開時、開花時、開花第1天和第3天的花藥,放入培養瓶中,置于有硅膠的干燥皿中待花藥干燥后散落于管中。待花粉充分散出后,每管滴入1%偏6磷酸溶液1 mL,加蓋充分搖勻,使花粉懸浮充分,XB-K-25型血球計算板統計花粉數量,重復6次[13],每個花藥花粉數量(個)=(80個小方格花粉?？倲怠?00×10 000×稀釋倍數)/80 。

1.4 花粉活力和萌發能力測定

采用I2-IK染色法測定花粉活力,取裂蕾期前花藥未裂開時、開花時、開花第1天和第3天花藥花粉,放在載玻片上滴入0.5% I2-IK溶液1～2滴,顯微鏡下觀察統計,每個發育期取花藥6個,每個花藥觀察5個視野數據,以著色花粉數量作為其活力指標?；ǚ刍盍?%)=有活力的花粉數/花粉總數×100[13]。

花粉萌發能力測定采用培養基萌發法,參考劉潔云等[14]的方法,取不同發育階段花藥花粉,放在有花粉培養基的凹面載玻片上,26 ℃下黑暗培養2 h,顯微鏡下檢測花粉管長度大于花粉直徑的花粉數量,每個發育期取花藥6個,每個花藥觀察5個視野數據,花粉萌發率(%)=萌發花粉數/花粉總數×100。

1.5 柱頭可授性的測定

取不同發育階段花朵柱頭置于培養瓶中,加入1%聯苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22的反應液,柱頭需全泡在反應液中,黑暗處理25 min,觀察柱狀顏色和氣泡產量數量判斷柱頭可育性。柱頭全變粉色,產生大量大氣泡的可育性最強,標記為+++;柱頭全變粉色,氣泡量較多的可育性較強,標記為++;柱頭一半以上染成粉色,氣泡量少為具有可育性,標記為+;柱頭粉色區域小于1/3,氣泡極少或沒有,部分有可育性,標記為-/+;柱頭無粉色或無氣泡,無可育性,記為-[13]。

1.6 異交指數(OCI)和花粉/胚珠(P/O)測定

隨機挑選完全打開花朵20朵,統計異交指數(OCI);同時解剖子房,觀察記錄胚珠數,計算花粉胚珠比(P/O),P/O =花粉總數/胚珠數。根據Dafni的異交指數標準[15]和Cruden的花粉/胚珠標準[16]判斷“欽蜜9號”的繁育系統類型,具體為花朵直徑<1 mm為0分,1～2 mm為1分,2～6 mm為2分,>6 mm,3分;雌雄蕊情況為花藥開裂,柱頭有可授性,或雌蕊先熟為0分,雄蕊先熟為1分,柱頭與花藥在同一高度為0分,空間分離為1分。OCI=花朵直徑得分+雌雄蕊得分;OCI為0時,閉花受精;OCI為1時,專性自交;OCI為2時,兼性自交;OCI為3時,自交親和,有時需要傳粉;OCI為4時,異交,部分自交親和,異交需要傳粉者。P/O=2.7～5.4為專性自交,P/O=18.1～38.0為兼性自交,P/O=2 588～396 244.7為兼性異交,P/O=2 108～195 525為專性異交。

1.7 傳粉方式試驗

擇標記好的花朵50朵,分別進行自然授粉、人工異花授粉、人工自花授粉和不授粉等4種處理,統計各處理著果數,計算著果率。

1.8 數據分析

采用Excel 2007軟件整理數據,SPSS 19.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 花器官各發育階段特征

“欽蜜9號”是較耐熱黃果西番蓮品種,經過多年調查發現,在夏季溫度超過35 ℃以上時仍正?；ㄑ糠只㈤_花結果?！皻J蜜9號”一般移植后40～50 d進入生殖期,可持續開花到當年10月,花朵開放時間一般為13:00—15:00,單花開放時間約24 h?！皻J蜜9號”進入生殖生長期后,在枝條葉片同節位卷須基部出現點狀突起的花芽,花芽分化完成后慢慢長大,苞片生長較快,1周后拔開苞片可以看到花蕾。苞片中可見點狀突起花蕾時記為現蕾0 d,整個發育進程大致可分為:現蕾期、花冠發育期、雌雄蕊成熟期、裂蕾開花期和謝花期(見圖2),持續時間約25～27 d。

注:1—4為現蕾期(現蕾0～6 d),5—9為花冠發育期(現蕾后7～12 d),10—12為雌雄蕊成熟期(現蕾后13～20 d),13-15為裂蕾開花期(現蕾后21～22 d),16—17為謝花期(現蕾后23 d和25 d)。

2.2 開花習性和花器官形態特征

“欽蜜9號”花開放可分為裂蕾、萼片打開、花瓣打開、雌雄蕊散開、花藥向上翻轉、柱頭向下接觸花藥、授粉等階段,花開放時的形態見圖2。

花朵完全開放時,即完全成熟花直徑平均值6.86 cm,最大值8.12 cm,最小值5.8 cm。萼片長平均值3.93 cm,最大值4.9 cm,最小值3.38 cm;寬平均值1.42 cm,最大值1.51 cm,最小值1.37 cm。薄膜狀花瓣長平均值4.23 cm,最大值5.01 cm,最小值3.33 cm;寬平均值1.44 cm,最大值1.54 cm,最小值1.38 cm。絲狀花瓣長平均值2.43 cm,最大值2.68 cm,最小值2.03 cm。萼筒直徑平均值1.05 cm,最大值1.32 cm,最小值0.82 cm;高度平均值1.45 cm,最大值1.74 cm,最小值1.21 cm。雄蕊,花藥柄長平均值0.94 cm,最大值1.02 cm,最小值0.9 cm?；ㄋ庨L平均值1.1 cm,最大值1.22 cm,最小值0.97 cm;寬平均值0.54 cm,最大值0.59 cm,最小值0.51 cm。雌蕊中,子房高度平均值0.6 cm,最大值0.67 cm,最小值0.55 cm;直徑平均值0.44 cm,最大值0.46 cm,最小值0.41 cm。柱頭寬平均值0.61 cm,最大值0.66 cm,最小值0.56 cm;長平均值1.43 cm,最大值1.58 cm,最小值1.36 cm。

從圖2可以看出,“欽蜜9號”花器官由花梗、苞片、萼片、薄膜狀花瓣、絲狀花瓣、雄蕊和雌蕊組成。苞片3片,長1.7～2.0 cm,寬1.5～1.8 cm,葉脈因有花青素而呈褐紅色斑點;萼片5枚,平均長度3.93 cm,平均寬度1.42 cm,外面為綠色,從基部向上顏色由淺綠色逐漸加深,至頂部為深綠色,每片萼片外部中間有條突起的脊;每片苞片和萼片上著生有數個小顆粒凸起的蜜腺。薄膜狀花瓣白色,5枚,平均長度4.23 cm,平均寬度1.44 cm;絲狀花瓣無數枚圍成一圈,尾部略卷曲,靠近花萼筒的約1/2長度為深紫色,外部約1/2長度為白色;花瓣基部與萼片底部聯合形成圓柱形萼筒,萼筒平均直徑1.05 cm,高度1.45 cm,萼筒內部有蜜腺。雄蕊5枚,長度一致,花藥黃色,長方形囊狀。子房上位,頂部柱頭3枚,綠色,柱頭分裂為二,呈蹄狀結構?；ㄋ幒椭^基部均著生于子房頂部,柱頭高度略高于花藥3～5 mm。

裂蕾后,花在當天13:00—15:00開放。開放時,花部外面包裹的5片綠色萼片逐片打開,接著白色薄膜花瓣打開,連同里面一圈絲狀花瓣也開始展開;5枚雄蕊緩慢向四周散開,此時花藥已裂開,散開后開裂的花藥囊轉頭向下;雄蕊散開后,原本聚攏在一起的雌蕊的3個柱頭也散開,此時整朵花完全開放?；ㄍ耆_放后,原來轉頭向下的花藥會慢慢地反轉向上,同時柱頭也向下彎,向花藥靠攏,最后碰在一起,花粉授到柱狀上,授粉完成,在開放過程中可以看到花粉也會黏到柱頭。授粉結束后1～2 d,可以觀察到子房明顯膨大,整朵花的花被部分又開始收攏,花藥、柱頭、花瓣、萼片等開始慢慢枯萎,進入謝花期,此后是果實生長期。

現蕾期:現蕾后3～4 d,花蕾直徑約1 mm,除絲狀花瓣外其他器官均已形成,雄蕊和柱狀為嫩綠色,花藥內部腔室已形成,花藥與子房緊密靠近?，F蕾后6 d時,花蕾直徑約2 mm,花蕾高度約至苞片的1/2,4個花藥室已清晰可見,并充滿內容物;萼片開始增厚,子房橫切面呈三角形,內膜可以看到一些小突起,子房與花藥有明顯的空隙。

花冠發育期:分3個時期,一是現蕾后7～8 d,花蕾橫徑0.4～0.8 cm,縱徑0.5～1.0 cm,縱橫徑比1.25,花蕾高度與苞片長度齊平,絲狀花瓣開始出現,最初為白色,1～2 d后基部開始變紫,此時萼片明顯變厚,胚珠已明顯可見,花藥顏色轉為黃色,柱頭深綠色,已有可授性?；ㄋ幨椅匆娒黠@內容物,子房橫切面從三角形慢慢變為圓形,子房與花藥的空隙變得更大。二是現蕾后9～11 d,花蕾橫徑0.8～1.4 cm,花蕾縱徑1.0～2.2 cm,縱橫徑比1.25～1.57,花蕾略超出苞片2～3 mm,絲狀花瓣基部變成紫色?；ㄋ幨页錆M內容物,子房長大,胚珠已明顯可見。三是現蕾后12～13 d,花蕾橫徑1.4～1.8 cm,花蕾縱徑2.2～3.0 cm,縱橫徑比1.57～1.67,苞片基本定形,苞片高至花蕾1/2位置,各器官不斷長大,子房與花藥之間已無明顯空隙。

雌雄蕊成熟期,分3個時期,一是現蕾后14～17 d,花蕾橫徑1.8～2.3 cm,花蕾縱徑3.0～3.8 cm,縱橫徑比1.65～1.67,苞片高至花蕾的1/3位置,各器官不斷長大,花藥室充滿內溶物,未看到成熟花粉粒。二是現蕾后18～19 d,花蕾橫徑2.3～2.5 cm,花蕾縱徑3.9～4.7 cm,縱橫徑比1.69～1.88,苞片與萼筒同高,花蕾飽滿,花藥未裂開,但已可以看到成熟花粉,此時萼筒基本定形,胚珠不斷長大并填滿子房腔室。三是現蕾后20～21 d,花蕾橫徑2.5～2.6 cm,花蕾縱徑4.8～4.9 cm,縱橫徑比1.88～1.92,花藥已開裂,花蕾縱橫徑基本定形。

裂蕾開花期,現蕾后21～22 d,花蕾橫徑2.6 cm,花蕾縱徑4.9 cm,縱橫徑比1.88,接近中午時開始裂蕾,13:00—15:00單花完全開放,開放后自花授粉約在1 h內完成,異花授粉主要通過昆蟲如蜜蜂傳粉。

謝花期,現蕾后22～27 d,授粉后2 d可以看到子房明顯膨大,花藥和子房開始有一點萎蔫,授粉后5 d時,子房直徑已經可以達到4～5 cm,此時大部分花的花藥和子房開始萎蔫或干枯(見圖3)。

注:O為子房,A為花藥,Sep為萼片,P為花粉,Ovu為胚珠。

2.3 不同發育階段花粉活性變化

“欽蜜9號”在開花前1～2 d(現蕾后19～20 d)時花粉粒開始成熟,培養基培養30 min后開始陸續萌發。從表1可以看出,‘欽蜜9號’花粉粒數量在開花當天最多,有7.94×105個/花藥 ,開花后花粉數量大量減少,授粉后第3天時花粉數量僅是開花當天的1/10左右?；ǚ刍钚跃?0%以上,開花當天和授粉后1 d花粉活性分別達到90.11% 和92.17%?；ǚ勖劝l率在開花當天達到最高,為67.69%,授粉后1 d萌發率下降至24.9%,授粉后3 d萌發率僅有19.55%?；ǚ坌螒B完整飽滿,畸形率非常低,在1.04%以下。

表1 “欽蜜9號”黃果西番蓮不同發育期花粉數量、活性及不同授粉處理著果情況

2.4 柱頭可授性

花蕾長至直徑約4～5 mm時,即現蕾后7～8 d,柱頭明顯變綠色,此時柱頭已有可授性,隨著花器官不斷發育和雌雄蕊成熟,柱頭產生的氣泡不斷增加,可授性不斷增強?，F蕾后12 d時柱頭可授性已較強,開花前3 d至開花前1 d(現蕾后18～21 d),柱頭可授性達到最強,開花當天可授性略微有所下降,但仍較強。授粉后柱頭可授性開始下降,至授粉后3 d柱頭可受性已大大減弱,但仍有可授性,此時柱頭已開始變干癟,顏色變成褐黃色。具體情況為現蕾后8、10、12、14、16、18、19、20、21、22、25 d柱頭可授性分別為+、+、++、++、++、+++、+++、+++、+++、+、-/+(+越多可授性越強)。

2.5 繁育系統評判

經觀察,“欽蜜9號”柱頭位置平均高于花藥3～5 mm,雌雄蕊在空間位置上有分離,柱頭在花瓣打開前就有可授性,花藥開裂時間在裂蕾前1 d。根據 Dafni的標準評分,“欽蜜9號”的OCI為4,推斷其繁育系統為異交型,部分自交親和,異交需要傳粉者?；ǚ?胚珠為3 163,屬于兼性異交類型。授粉試驗結果表明,“欽蜜9號”自花和異花均可育,且自交與雜交親和性均較高(見表1),驗證了前面的繁育類型。

3 討論

3.1 “欽蜜9號”花器官發育進程特征

通過花器官發育過程中各階段表型性狀與內部器官發育進程相關聯分析,可以從花蕾外觀快速判斷花蕾內部各器官的生長發育階段,這對雜交育種工作中選擇適合的雜交時間非常重要。本研究結果表明,“欽蜜9號”在開花前1～2 d,花藥未裂時花粉粒已成熟,如果需要進行異花授粉,應該在此時進行?！皻J蜜9號”在亞熱帶低海拔地區高溫夏季仍可連續開花,現蕾后19～20 d花粉粒開始成熟,一般選擇溫度較高的午后開花,可能是其開花需要較多熱量。在廣西南寧高溫夏季,該品種花器官發育未見有敗育階段,花粉數量、花粉活性及柱頭可授性均正常,說明其花器官發育過程較耐高溫,這與許多耐高溫作物花器官性狀相似[17-19]。植物開花后可自花授粉亦可異花授粉,且兩種傳粉方式的親和性均較高,這可能是其對環境適應的一種調節特性,即可以保證其近交優勢,又可以增加遺傳多樣性[20-21]?；ǚ蹟盗考捌浠钚?、柱頭可育性、花粉活性與柱頭可育性是否同期等均會影響植物授粉效果和結果率[22-23]。本研究結果表明,“欽蜜9號”花粉數量和活性非常高,顆粒飽滿,畸形率較低,開花時花粉萌發率也較高,同時柱頭可授性在花粉活性和萌發最高時也達到最強,并且在時期上有重疊,創造了其自花授粉的良好條件。本研究也發現,“欽蜜9號”在開花前1～2 d時,花粉粒已成熟同時具有較高活性和萌發率,且花藥和柱頭存在空間一定距離的分離,這種特性使雜交處理操作方便[24-25]。因此,“欽蜜9號”雜交既可以作為母本,也可作為父本。

3.2 “欽蜜9號”繁育系統特征及利用

根據Cruden和Dafni的標準,“欽蜜9號”繁育系統屬于兼性異交,繁育方式為異交型,部分自交親和,異交需要傳粉者,為自交和異交混合交配系統;混合交配系統一般被認為是植物適應環境的最適交配體系[24-26],人工處理的結果也驗證這一結論。本研究發現,“欽蜜9號”自交和異交親和性均較高,這與其他異交植物不同[27-28];一般來說異交植物提高異交率,自交親和力會較低,或通過花粉活性與柱頭可授性不同期來避免自交發生,“欽蜜9號”自交和異交高親和性比較特殊。此外,本研究結果發現,“欽蜜9號”花粉和柱頭在開花5 d內雖然活性和可育性大多下降 ,但還具有一定育性,因此雜交后一定做好防護工作,以防其他花粉再次授到柱頭上。

“欽蜜9號”兼具有性繁殖與無性繁殖,這可能是植物應對多變環境的生殖補償機制,可以保證其后代延續[16,29]。本研究結果也發現,“欽蜜9號”柱頭可授性和花粉萌發率在開花后2～3 d大幅下降,開花時間一般為24 h左右,這會影響其有性繁殖的概率,生產實踐中也發現開花后如遇大風大雨天氣,授粉率和結果率會大大降低,因此,可以利用其雜交親和性高的特點,先通過有性雜交聚合不同品種優良性狀,創制優良種質,篩選優異雜交后代后,再通過無性繁殖快速擴繁獲得大量優異種群,再進一步篩選后代優良株系,以獲得性狀穩定的優株。

4 結論

“欽蜜9號”耐熱性體現在其花器官繁育系統發育進程不受高溫影響,花粉數量多、活性強,柱頭可育性強,花粉活性與柱頭可育性同步性高度一致,保證了其高結果率。其自交與異交親和性均較高,雜交時既可作父本,也可作母本。本研究主要針對其花器官發育進程特征和繁育系統特性進行研究,仍需對該品種耐熱性的生理生化過程和分子機制開展深入研究,以期能全面挖掘“欽蜜9號”的耐熱機制,為西番蓮耐熱抗性育種奠定基礎。