基于“時空特點”探討電針預處理對腦缺血大鼠鈉鈣交換體1的影響

寧文華,李 禮,3△,張寶瑜,楊 沙,張麗麗,樊小農,沈 燕,4,張亞男,王 舒

1.天津中醫藥大學第一附屬醫院,天津 300381;2.國家中醫針灸臨床醫學研究中心,天津 300381;3.天津市針灸學重點實驗室,天津 300381;4.國家中醫藥管理局腦病針刺療法重點研究室,天津 300381;5.天津市中醫藥研究院附屬醫院,天津 300120

腦卒中是世界第二大致死因素、第三大致殘因素,缺血性腦卒中占80%[1]。重組組織纖溶酶原激活劑仍是唯一批準用于治療缺血性腦卒中的藥物,但在臨床實踐中卻因其治療時間窗窄(4.5 h內)、嚴格的禁忌癥以及治療過程中可能存在的并發癥(顱內出血等)而無法使更多人受益[2-3];動物模型中顯效的卒中神經保護藥物,在進行臨床轉化過程中卻均以失敗告終[4]。因此,繼續探索治療缺血性腦卒中的有效措施是神經科學領域關注的重點課題。尋找預防腦卒中首次發生的最佳方案是卒中研究任務的重中之重[5]。課題組前期已證實[6],缺血前重復刺激大鼠“百會”、雙側“內關”和“三陰交”可以抑制神經細胞凋亡,發揮腦保護作用,然而其具體作用機制尚未完全闡明。

Ca2+超載是缺血性神經元死亡的主要因素[7],降低細胞內Ca2+濃度可以發揮神經保護作用[8]。鈉鈣交換體(Na+/Ca2+exchanger,NCX)作為分布于細胞質膜上的雙向膜離子轉運體,由于其高轉運能力是神經元Ca2+外排的主要途徑。NCX1是NCX中最重要的亞型,通過調控NCX1表達及活性,在缺血性腦卒中的治療中具有關鍵作用[9],可作為卒中干預的潛在靶標[10]。本實驗在前期明確電針預處理腦保護效應的基礎上,選擇細胞質膜Ca2+外排關鍵通道NCX1為切入點,進一步觀察電針預處理對腦缺血不同時間點、不同缺血區域NCX1表達的影響,探討電針預處理腦保護的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級SD(Sprague-Dawley)大鼠,5～6周齡,雄性,體質量230～250 g,均購自于北京維通利華實驗動物技術有限公司。實驗動物飼養于中國科學院放射醫學研究所,符合(Specefic Pathogen Free,SPF)級標準,飼養溫度(22±2)℃,相對濕度(55±15)%,12 h/12 h明暗交替,自由飲水及進食。實驗大鼠隨機分為假手術組、模型組與電針組,每組再分0、1、2和24 h亞組,每亞組各7只。假手術組、模型組0 h于手術后立即斷頭取腦,電針組0 h于末次干預后立即取材,其余1、2和24 h時間點均于造模結束后開始計時。所進行動物實驗經天津中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(審批號:TCM-LAEC2019019)。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器 韓氏神經穴位刺激儀(南京濟生);激光多普勒血流儀DRT4(美國惠普公司);大鼠腦槽(深圳瑞沃德);針灸針(北京漢醫);線栓(深圳瑞沃德);異氟烷(深圳瑞沃德);超聲波細胞粉碎機(寧波新芝);小型臺式高速冷凍離心機(美國ThermoFisher);電泳儀(美國Bio-Rad);多功能成像儀(德國耶拿);多功能脫色搖床(美國ThermoFisher);生物組織脫水機(浙江金華科迪);生物組織包埋機(浙江金華科迪);切片機(德國Leica)。

1.2.2 試劑 高效RIPA裂解液(北京索萊寶);BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德);SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(武漢博士);彩虹廣譜蛋白Marker(北京索萊寶);20TBST緩沖液(北京索萊寶);5%脫脂牛奶(美國BD);兔抗NCX1單克隆抗體(美國Abcam);小鼠抗NCX1單克隆抗體(美國Abcam);小鼠抗β-actin抗體(北京中杉金橋);HRP標記山羊抗兔IgG抗體(北京全式金);HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體(北京全式金);PVDF膜(美國Millipore);ECL化學發光液(美國Millipore);無水乙醇(天津化學試劑廠);二甲苯(天津化學試劑廠);檸檬酸鈉抗原修復液(北京索萊寶);鼠組化二抗試劑盒(北京中杉金橋);蘇木素染液(北京索萊寶);中性樹膠(北京索萊寶);4%組織固定液(北京索萊寶)。

1.3 干預方法

采用自制鼠衣束縛實驗大鼠,并用膠帶固定于實驗臺上,確保大鼠腹部朝上,充分暴露針刺部位,見圖1。電針預處理穴位選取大鼠“百會”、雙側“內關”“三陰交”。根據《實驗針灸學》[11]大鼠穴圖譜進行定位,“百會”(GV20)取大鼠頂骨正中點,沿皮向后斜刺2 mm;“內關”(PC6)取大鼠前肢內側,腕關節上3 mm左右的尺橈骨之間,直刺2 mm;“三陰交”(SP6)取大鼠后肢內踝尖上5 mm,直刺1.5 mm。電針預處理參數為疏密波,頻率2/15 Hz,強度1 mA,時間20 min。1次/d,連續5 d,于末次電針2 h后制備模型。

圖1 電針干預示意圖

1.4 造模方法

通過線栓法阻閉大腦中動脈,構建大鼠永久性腦缺血模型,具體操作方法:①實驗大鼠于術前12 h禁食不禁水。采用異氟烷氣體吸入性麻醉(4%誘導,2%維持)。待麻醉起效后于大鼠頭皮正中切一2 cm開口,鈍性分離皮下組織、骨膜,暴露冠狀縫和矢狀縫,將激光多普勒血流儀(DRT4)探頭固定于冠狀縫后4 mm,矢狀縫向右旁開3 mm處,用以監測局部腦組織血流量的變化;②將實驗大鼠以仰臥位固定于鼠板上,頸前皮膚備皮、消毒,于頸部正中行2 cm切口,鈍性分離頸前組織,充分暴露頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈;③尼龍繩結扎右側頸總動脈、頸外動脈后,動脈夾夾閉右側頸內動脈,用彎針于頸總動脈開一小切口;④將線栓由頸總動脈緩慢插入大腦中動脈,并通過血流儀觀察血流阻閉情況,當腦血流趨于穩定后較基線值降低70%視為造模成功,見圖2;⑤結扎固定線栓,逐層縫合頸前肌肉,碘伏消毒,將大鼠移至恒溫箱,蘇醒后移至飼養籠。

注:A點標記處為基線血流值,B點標記處為線栓阻塞后血流值。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 免疫組化法觀察大鼠缺血區、非缺血區皮層NCX1陽性細胞數 大鼠異氟烷吸入性麻醉后仰臥位固定于鼠板,剪開胸腔,充分暴露心臟,剪開右心耳,快速推注生理鹽水,而后推注4%多聚甲醛,至四肢抽動。灌注結束后,斷頭取腦并置入4%多聚甲醛中固定。石蠟包埋、切片(4 μm)和脫蠟。將切片置于高壓鍋中用0.1%檸檬酸鈉抗原修復。PBS沖洗5次,每次2 min;5%BSA封閉20 min。將稀釋好的NCX1(1∶100)一抗滴加于組織上,4 ℃冰箱過夜;次日用PBS清洗切片5次,每次5 min,滴加二抗增強劑,室溫孵育20 min;再用PBS清洗5次,每次5 min,加二抗(1∶100)室溫孵育30 min。用PBS清洗5次,每次5 min,DAB顯色,蘇木素復染,脫水、透明和中性樹膠封片,晾干。在顯微鏡下進行觀察,每張切片于400倍視野下隨機選擇5個互不重疊視野,采用Image J軟件分別計算每個視野中NCX1的陽性細胞數量,取其平均值。

1.5.2 Western blot法檢測大鼠缺血區、非缺血區NCX1蛋白表達 大鼠麻醉斷頭取腦,提取前述位相應區域皮層腦組織,加入含PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,使用超聲勻漿機勻漿、離心,而后吸取上清,進行蛋白定量。計算蛋白樣品濃度之后,加入5蛋白上樣緩沖液,跨膜蛋白變性條件為37 ℃,15 min。采用10%SDS-PAGE凝膠進行電泳,將蛋白轉移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h,分別加入β-actin(1∶2 000)、NCX1(1∶2 000)一抗,4 ℃孵育過夜。次日將抗體孵育盒從冰箱取出,室溫搖床復溫1 h。TBST緩沖液清洗PVDF膜,3次,每次10 min。清洗結束后,加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000),室溫搖床孵育1 h,之后再次置于TBST緩沖液中,洗3次,每次10 min。隨后加入ECL化學發光液,使用多功能成像儀顯影。用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析,以目的條帶灰度值與內參灰度值比值,作為各樣本相對表達量結果進行分析。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 電針預處理對MCAO大鼠缺血區皮層NCX1陽性細胞表達的影響

NCX1在細胞膜陽性表達,3組間0 h時相NCX1蛋白陽性表達比較差異無統計學意義(P>0.05);與同時相假手術組比較,模型組1 h、2 h和24 h時相NCX1蛋白陽性表達顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.01);電針組NCX1蛋白陽性表達于1 h、2 h時顯著高于同時相模型組比較,差異具有統計學意義(P<0.05),24 h時與同時相模型組,差異無統計學意義(P>0.05);提示電針預處理可上調缺血區皮層1 h、2 h時相NCX1蛋白陽性表達。見圖3、表1。

表1 各組大鼠不同時相缺血區皮層NCX1陽性細胞表達個數比較

2.2 電針預處理對MCAO大鼠缺血區皮層NCX1蛋白表達的影響

3組間0 h時相NCX1蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05);模型組NCX1蛋白表達于1 h后開始降低,1 h、2 h和24 h均低于同時相假手術組,差異具有統計學意義(P<0.01);電針組NCX1蛋白表達于1 h、2 h顯著高于同時相模型組,差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01),24 h時與同時相模型組,差異無統計學意義(P>0.05);提示電針預處理可上調缺血區皮層1 h、2 h時相NCX1蛋白表達。見圖4、表2。

表2 各組大鼠缺血區皮層NCX1蛋白表達比較

圖4 各組大鼠不同時相缺血區皮層NCX1蛋白表達電泳圖

2.3 電針預處理對MCAO大鼠非缺血區皮層NCX1陽性細胞表達的影響

由圖5可見NCX1在細胞膜陽性表達,3組間0 h時相NCX1蛋白陽性表達比較差異無統計學意義(P>0.05);與同時相假手術組比較,模型組2 h、24 h時相NCX1蛋白陽性表達顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.05);電針組2 h、24 h時NCX1蛋白陽性表達明顯高于同時相模型組,差異有統計學意義(P<0.05);提示電針預處理可上調非缺血區皮層2 h、24 h時相NCX1蛋白陽性表達。見圖5、表3。

表3 各組大鼠不同時相非缺血區皮層NCX1陽性細胞表達個數比較

圖5 各組大鼠不同時相缺血區皮層NCX1陽性細胞分布(400×)

2.4 電針預處理對MCAO大鼠非缺血區皮層NCX1蛋白表達的影響

3組間0 h時相NCX1蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05);與同時相假手術組比較,模型組NCX1蛋白表達于2 h、24 h顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.01),電針組可上調2 h、24 h時NCX1蛋白表達,與同時相模型組比較,差異具有統計學意義(P<0.01);提示電針預處理可上調非缺血區皮層2 h、24 h時相NCX1蛋白表達。見圖6、表4。

表4 各組大鼠非缺血區皮層NCX1蛋白表達比較

圖6 各組大鼠不同時相非缺血區皮層NCX1蛋白表達電泳圖

3 討論

Ca2+水平的時空控制對于細胞結局至關重要[12]。腦缺血發生后,血流受阻,氧和葡萄糖供應不足,細胞三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)降低,Na+/K+ATPase難以維持正常的電化學梯度,導致神經細胞去極化,細胞內離子穩態失衡,Ca2+濃度升高[8],觸發下游神經毒性級聯,最終導致細胞死亡。而促進Ca2+外排有助于神經元存活并減輕腦缺血損傷[13]。NCX是細胞質膜上負責Ca2+外排的主要途徑,維持Ca2+外排,以平衡細胞去極化或細胞內Ca2+釋放過程中引起的Ca2+瞬變[12],通過調控其表達及活性可以改善腦缺血損傷。NCX1是NCX中最重要的亞型,與腦保護效應密切相關。本研究通過構建永久性腦缺血模型,以細胞質膜Ca2+外排關鍵通道NCX1為切入點,分別從時間、空間角度探討電針預處理調控NCX1應答的作用機制。

針灸治療缺血性腦卒中療效確切[14],電針作為傳統針灸與現代電刺激的結合,具有簡便、穩定和安全等特點,在缺血性腦卒中的臨床治療中應用廣泛[15]。百會穴位于巔頂,屬督脈,有升補人體陽氣、調神醒腦的作用,是治療中風的常用穴位[16]。內關穴為手厥陰心包經絡穴,是醒腦開竅針法的主穴。三陰交穴屬于足太陰脾經,為足三陰經交會穴,具有調理肝脾腎三臟功能,可以滋補肝腎,調理氣血。卒中前進行電針預處理旨在鼓舞正氣以抗邪,達“正氣存內,邪不可干”之效,治宜調神、滋補肝腎和調理氣血。

針刺所引起機體機能活動的改變可以視作一種人體的負反饋調控現象。在正常狀態下針刺預處理并不會改變機體的機能狀態,針刺的負反饋是在病理損傷之后出現,并可縮短針刺效應潛伏期、促進針刺效應的發揮[17]。首先,由于尚不清楚電針預處理對NCX1蛋白表達的調節是始于缺血前的預處理還是缺血后的應激反應,因此本研究設置0 h時間點用以明確電針預處理對NCX1調節起始的時間節點,結果可以發現,在缺血區及非缺血區,電針預處理對缺血前NCX1蛋白表達影響并無統計學差異,其明顯改變始于損傷之后,原因可能在于電針預處理的作用始于缺血應激后產生,表現為提高缺血后應對組織損傷的能力。但值得注意的是,各個區域0 h時相電針組NCX1蛋白表達與同時相假手術組相比,仍存在一定的降低趨勢,是否可以考慮電針預處理能夠在一定程度上使腦組織適應血流低灌注狀態,促使細胞維持低Ca2+外排機能,從而提高腦組織易損傷閾值來誘導缺血耐受,后續可以針對此現象繼續探索。

由于蛋白質合成活性的區域性差異,不同區域NCX1變化有所不同。大腦的主要動脈區域是通過側支循環連接起來的,因此在缺血區內存在組織灌注的異質性,腦血管的閉塞會導致腦內血流量的減少,缺血組織的嚴重程度從血管供血區域的外圍向中心部分增加。缺血區距離側支血供最遠且腦血流降低最嚴重,隨著ATP的迅速降低,該區域組織活性受損,大量細胞丟失,快速發展為不可逆損傷[18]。事實上,缺血事件的發生并不會只影響某單一區域,對于腦整體功能網絡的恢復,應關注大腦整體結構[19-20]。大腦皮層是由高度相互關聯的神經細胞組成,各腦區之間依靠神經纖維聯系為緊密的腦功能網絡,與組織損傷相連的對側非缺血區域,由于代謝不足、神經血管解偶聯和神經傳遞異常同樣表現出功能受損,其功能狀態與腦損傷程度有關[21]。卒中腦功能的恢復在一定程度上受到未受損神經元代償連接的影響,局灶性腦損傷后,未受損神經元連接發生變化,促使其承擔缺血損傷區域的某些功能,而通過刺激對側非缺血區功能代償,調整腦功能網絡,可有效促進卒中后腦功能重塑[22-23]。往常實驗研究普遍將重心關注于缺血側半腦,對于對側非缺血區在整個缺血過程中的作用及是否產生變化仍有待進一步闡明。本研究基于整體出發,更系統而全面的觀測缺血后大腦不同組織區域的病理變化及電針預處理作用機制。研究發現,缺血區、非缺血區皮層NCX1蛋白表達均呈現不同程度的降低,這可能是其Ca2+外排能力受損的表現,而NCX1表達發生變化,可以體現細胞控制胞內Ca2+能力的改變,其表達水平降低,影響細胞Ca2+外排效能,導致Ca2+超載甚至神經元死亡[24]。電針作用的整體性特點決定電針作用的發揮重點在于調控大腦整體應答模式。對于腦組織損傷發展迅速的嚴重缺血區域即缺血區,NCX1蛋白表達于缺血后1 h開始降低,2 h即達到最低值,而電針預處理的作用只維持在2 h內,2 h后其效應持續降低,至24 h時間點與同時相模型組相比無明顯差異。這種現象可能是由于缺血區病理進展迅速,離子穩態快速破壞,破壞該區域NCX1蛋白合成,NCX1表達快速降低,Ca2+外排受損并在胞內堆積,而該區域組織損傷的不可逆性,可能是造成電針預處理作用短暫的主要原因。對側非缺血區皮層NCX1蛋白表達同樣發生改變,遲于缺血區域,于2 h后開始降低并持續到24 h,仍低于正常水平,可能是非缺血區失代償的表現。電針預處理可上調非缺血區皮層NCX1表達,使之始終維持于正常水平,有助于缺血損傷后腦功能恢復。

綜上所述,腦缺血后NCX1蛋白隨著時間及空間的不同而呈現出不同的降低趨勢,電針預處理調控不同區域NCX1蛋白表達模式,可能是其腦保護作用途徑之一。