根灌外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿生理特性的影響研究

張 玲,麻冬梅*,劉曉霞,馬巧利,侯汶君,李嘉文,蘇立娜,杭嘉慧

(1.寧夏大學西北土地退化與生態系統恢復省部共建國家重點實驗室培育基地/西北退化生態系統恢復與重建教育部重點實驗室,寧夏大學生態環境學院,寧夏 銀川 750021; 2.寧夏大學林業與草業學院,寧夏 銀川 750021)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是享有“牧草之王”美譽的豆科多年生草本植物,因其固氮能力強,蛋白質含量高、產量高,營養物質豐富,成為我國栽培面積最大的飼草作物之一[1]。截至2019年,我國紫花苜蓿商品草種植面積已達4.4×109m2,但隨著畜牧業快速發展和工廠化養殖快速推廣,我國優質飼草需求仍有40%～60%的缺口,紫花苜蓿所具有的生態和經濟價值使其成為飼料行業的主力軍[2-4]。干旱是抑制植物生長最嚴重的非生物脅迫之一,干旱發生后,細胞器產生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS),生成大量過氧化物,膜脂過氧化加劇,影響細胞的正常代謝,抑制植物光合作用[5]。對植物的品質和產量產生影響的同時,也會限制植物的地理分布[6]。干旱破壞ROS產生和清除間的平衡,產生大量H2O2,過量活性氧積累對細胞膜造成損傷—破壞核酸、氧化蛋白質、引起脂質過氧化,H2O2是極具細胞毒性的活性氧之一,大量積累嚴重影響正常代謝[7-8]。因此,確定應對干旱脅迫的戰略,對全球農業的可持續發展具有重要意義。紫花苜蓿雖然可以抵擋一定程度的干旱,但是隨著全球氣候變化加劇,畜牧業發展牧草需求量增加,如何維持干旱脅迫下紫花苜蓿的生長和產量,保障其高效發揮生態效益已經成為亟待解決的關鍵問題。

褪黑素(Melatonin,MT)是一種調節晝夜節律、調控植物生長的吲哚胺植物激素[9]。它首先在動物體內被發現,自1995年以來,在多種植物的根、葉、種子和果實中檢測到褪黑激素的存在[10-11],2018年研究人員在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發現第一個植物褪黑激素受體—CAND2/PMTR1[12]。大量研究表明褪黑素對不良環境下作物耐受性提高有正向作用[13],其中包括清除活性氧、增加滲透調節物質、降低鹽脅迫對葉綠素的破壞,調控抗逆基因的表達,從而提高植物抗逆性[14-15]。褪黑素可以緩解各種類型的非生物脅迫,如鹽堿、干旱、極端溫度和重金屬等[16-18],并在植物中作為滲透調節物質,維持細胞質穩態和調節生長[19]。桃苗(Prunuspersica)經褪黑素預處理后氣孔開度減小,褪黑素增強干旱脅迫下桃苗根系活力,提高葉片相對含水量和相對葉綠素含量,并提高DREB1A,DREB2A,LEA和PIP1等逆境響應基因的表達量[20]。外源褪黑素提高鹽脅迫下煙草(NicotianatabacumL.)葉片含水率、過氧化物酶活性,降低H2O2和丙二醛含量[21]。先前的研究主要集中在干旱對植物種子萌發或幼苗生長的影響,而關于外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿的調節作用研究較少。本研究以紫花苜蓿品種‘中苜3號’為材料,采用盆栽根灌褪黑素的方法,分析褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿生長及生理方面的影響,探討褪黑素緩解紫花苜蓿干旱脅迫可能的生理機制,以期利用褪黑素為紫花苜蓿抵御干旱提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料與干旱處理

本盆栽試驗于2022年4月在寧夏大學生態環境學院氣候室進行,試驗材料為‘中苜3號’紫花苜蓿。每個花盆裝有500 g過篩的壤土,土壤選用寧夏本地土壤混合基質土,每盆播種八粒種子,紫花苜蓿幼苗生長至12 cm高時,保留長勢一致幼苗每盆六株,進行連續三天根灌100 mL不同濃度褪黑素,對照組(CK)及干旱組(D)根灌等量水,在第3次根灌褪黑素的次日,除對照組正常澆水外,其余處理均進行自然漸進式干旱,控制澆水,達到中度干旱(土壤相對含水量在40%～45%)程度,通過稱重法每兩天補充蒸發散失的蒸餾水。試驗共設7個處理:① CK;②干旱(D);③干旱+30 μmol·L-1MT(D30MT);④干旱+60 μmol·L-1MT(D60MT);⑤干旱+90 μmol·L-1MT(D90MT);⑥干旱+120 μmol·L-1MT(D120MT);⑦干旱+150 μmol·L-1MT(D150MT),每個處理3個重復。干旱處理14天后,于早上9∶00隨機選取不同處理下紫花苜蓿幼苗12株,葉綠素含量測定自莖頂部數第2片葉,生理指標測定自莖頂部數第2～4片葉(葉片取下后立即置于-80℃冰箱保存),試驗設置3次重復。

1.2 生長指標測定

隨機選取不同處理下紫花苜蓿幼苗12株,株高(莖基部到主莖頂部距離)使用卷尺測量,莖粗(子葉下部)以游標卡尺測量(直徑)。

1.3 相對電導率、丙二醛、H2O2含量的測定

根據改良的Cen等[22]方法測量相對電導率(Relative electrical conductivity,REC),稱取0.2 g葉片置于裝有20 mL去離子水的玻璃管中,室溫靜置12 h,測量電導率E1后,100℃煮沸30 min,待溶液冷卻測量電導率E2。

REC=(E1/E2)×100%

丙二醛含量根據Zhang等[23]的方法采用硫代巴比妥酸法測定,分別測量在532,600,450 nm波長下的吸光度值;Zhang等人建議,在415 nm處用分光光度法測定紫花苜蓿葉片中H2O2濃度。

1.4 滲透調節物質含量的測定

蒽酮比色法測定可溶性糖(Soluble sugar,SS)含量;茚三酮比色法測定脯氨酸含量;可溶性蛋白含量測定根據考馬斯亮藍法[24]。

1.5 葉片相對葉綠素含量、相對含水量的測定

相對葉綠素含量使用便攜式葉綠素儀測定。葉片相對含水量(Relative water content,RWC)使用以下公式計算,稱取約0.1 g葉片記為鮮重,置于蒸餾水中浸泡24 h,至達到恒定重量,擦干葉片水分稱量飽和重,然后于80℃烘箱中干燥至恒重,記為干重。

1.6 抗氧化酶活性測定

取紫花苜蓿葉樣品0.5 g在液氮中研磨,加入預冷磷酸緩沖溶液(pH = 7.9)7.2 mL,在4℃下孵育15 min。孵育完成后將溶液在4℃下12 000 g·min-1離心15 min;上清液用于測定抗氧化酶活性。參考高俊鳳等的方法進行超氧化物歧化酶(Superoxidase dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、過氧化物酶(Peroxidase,POD)、抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)活性的測定[24]。

1.7 總RNA提取及基因表達分析

稱取0.1 g冷凍葉片加入液氮預冷的研缽中研磨成粉末,總RNA提取根據TIANGEN總RNA提取試劑盒(RNAprep Pure Plant Plus Kit)進行,使用超微量紫外分光光度計和0.5%瓊脂糖凝膠檢測RNA純度及濃度,按照Vazyme反轉錄試劑盒HiScript All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR將檢測合格RNA反轉錄合成cDNA。MsCu/Zn-SOD,MsPOD,MsCAT,MsAPX引物根據Niu等[25]的研究設計。qRT-PCR的反應條件為:95℃,30 s,95℃,5 s,60℃,20 s,72℃,30 s,循環40次。內參基因選擇紫花苜蓿肌動蛋白基因Actin。每個樣品設置3次重復,基因相對表達水平根據2-ΔΔCt法計算,引物信息在表1列出。

表1 引物設計Table 1 qRT-PCR analysis primers

1.8 數據處理

運用Microsoft Office excel 2021對數據進行整理,使用SPSS 25.0數據處理系統進行單因素方差分析和Duncan(P<0.05)多重比較,采用Origin 2022軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿株高和莖粗的影響

如圖1所示,干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗生長受到抑制,尤其是對株高、莖粗影響較大。與對照CK相比,干旱脅迫(D,中度干旱,土壤相對含水量為40%～45%)處理組的幼苗株高、莖粗分別顯著降低了55%,34%(圖2)(P<0.05)。對褪黑素緩解干旱效應的探究試驗中發現,與不添加褪黑素的干旱D處理組相比,添加60,90和120 μmol·L-1褪黑素可顯著改善干旱脅迫的紫花苜蓿幼苗的生長性狀(P<0.05)。與干旱脅迫(D,中度干旱,土壤相對含水量為40%～45%)相比,D90MT處理的苜蓿幼苗的株高和莖粗分別顯著增加了75%和41%,效果最顯著(P<0.05)。因此高濃度褪黑素對干旱脅迫下植物生長的緩解作用較小?？梢娛┘雍线m濃度的外源褪黑素能夠有效減輕干旱對植物造成的負面影響,其中90 μmol·L-1緩解效果最為明顯。

圖1 不同處理下紫花苜蓿幼苗生長狀況Fig.1 Growth of alfalfa seedlings under different treatments注:CK,正常澆水處理;D,干旱脅迫處理;D30MT,干旱脅迫處理+30 μmol·L-1 MT; D60MT,干旱脅迫處理+60 μmol·L-1 MT;D90MT,干旱脅迫處理+90 μmol·L-1 MT;D120MT,干旱脅迫處理+120 μmol·L-1 MT;D150MT,干旱脅迫處理+150 μmol·L-1;MT,褪黑素,下同Note:CK,the well-watered treatment;D,the drought stress treatment;D30MT,the drought stress treatment+30 μmol·L-1 MT;D60MT,the drought stress treatment+60 μmol·L-1 MT;D90MT,the drought stress treatment+90 μmol·L-1 MT;D120MT,the drought stress treatment+120 μmol·L-1 MT;D150MT,the drought stress treatment+150 μmol·L-1 MT;MT,Melatonin. The same as below

圖2 外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿株高和莖粗的影響Fig.2 Effects of exogenous melatonin on the plant height and stem diameter of alfalfa seedlings under drought stress注:A,株高;B,莖粗。數據柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Note:Panel A:Plant height;Panel B:Stem diameter. Value columns with different lowercase letters mean a significant difference (P<0.05) between different treatments. The same as below

2.2 外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿葉片膜透性的影響

植物由于長期缺水造成細胞膜受損。如圖3所示,與CK相比,干旱處理造成紫花苜蓿幼苗葉片相對電導率(REC)、MDA及H2O2含量顯著上升,分別增加了96%,194%和94%(P<0.05)。經褪黑素預處理后植株減少了REC,MDA及H2O2的產生。與D處理相比,60,90,120 μmol·L-1MT均顯著降低了各指標的水平(P<0.05),其中,D90MT處理降低REC、MDA效果更明顯,與D處理相比,分別減少了31%和49%,干旱與90 μmol·L-1褪黑素復合處理紫花苜蓿幼苗MDA含量與對照組無顯著差異。與D相比,120 μmol·L-1MT預處理紫花苜蓿幼苗經受干旱后H2O2含量最低,顯著降低了41%(P<0.05)。

圖3 外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿葉片膜脂過氧化產物的影響Fig.3 Effects of exogenous melatonin on the products of membrane lipid peroxidation of leaves of alfalfa seedlings under drought stress注:A,相對電導率;B,丙二醛含量;C,過氧化氫含量Note:Panel A,Relative electrolytic leakage;Panel B,Malondialdehyde content;Panel C,Hydrogen peroxide content

2.3 外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿滲透調節物質含量的影響

如圖4所示,與對照組CK相比,干旱脅迫下脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量分別顯著上升了194%,119%和67%(P<0.05);干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗施加褪黑素處理顯著降低了脯氨酸的水平,其中以D90MT,D120MT處理的Pro含量最低,分別減少了51%和53%(P<0.05)。中高濃度褪黑素對降低可溶性糖和可溶性蛋白含量有顯著作用,90 μmol·L-1MT處理紫花苜蓿幼苗可溶性糖含量最接近對照組,與D處理相比減少了46%(P<0.05)。低濃度(30 μmol·L-1)褪黑素對干旱脅迫下葉片可溶性蛋白含量影響不明顯,60,90,120,150 μmol·L-1MT相比于D處理分別減少了24%,25%,20%,15%。

圖4 外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿滲透調節物質含量的影響Fig.4 Effects of exogenous melatonin on the content of osmotic regulatory substances of the leaves of alfalfa seedlings under drought stress注:A,脯氨酸含量;B,可溶性糖含量:C,可溶性蛋白含量Note:Panel A,Proline content;Panel B,Soluble sugar content;Panel C,Soluble protein content

2.4 外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿葉片RWC和相對葉綠素含量的影響

葉片水分狀態受相對含水量(RWC)影響。如圖5A所示,與CK相比,干旱脅迫下RWC減少了49%。60,90,120,150 μmol·L-1MT處理均可顯著提升葉片相對含水量(P<0.05),90 μmol·L-1MT是最有益的處理,它導致干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗的RWC較D處理增加了89%,且與對照組無顯著差異。干旱導致葉片缺水、發黃枯落,相對葉綠素含量顯著降低(P<0.05)。通過添加外源褪黑素,顯著增加了干旱脅迫下相對葉綠素含量(P<0.05)。D90MT,D120MT處理顯著提高了葉片相對葉綠素含量,與D處理相比,分別增加了50%,29%(圖5B)(P<0.05)。

圖5 外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿葉片RWC和相對葉綠素含量的影響Fig.5 Effects of exogenous melatonin on RWC and relative chlorophyll content of leaves of alfalfa seedlings under drought stress注:A,相對含水量;B,相對葉綠素含量Note:Panel A,Relative water content;Panel B,Relative chlorophyll content

2.5 外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜?？寡趸富钚缘挠绊?/h3>

逆境導致植物體內ROS積累增加,破壞了原本的ROS產生與消除之間的平衡,植物為應對這一變化,增強體內抗氧化酶(SOD,POD,CAT,APX)含量以清除ROS。如圖6所示,干旱脅迫導致植物體內抗氧化酶含量顯著上升,與CK相比,D處理中SOD,POD,CAT,APX活性顯著增加了96%,109%,33%,23%(P<0.05),中高濃度褪黑素使抗氧化酶含量進一步提升,低濃度褪黑素可以提高抗氧化酶活性。與干旱脅迫相比,干旱與褪黑素復合處理(D90MT,D120MT,D150MT)幼苗葉片SOD活性顯著增加了53%,45%,36%(圖6A);POD活性顯著增加了56%,44%,50%(圖6B);CAT活性顯著增加了46%,32%,32%(圖6C);APX活性顯著增加了31%,28%,31%(圖6D)(P<0.05)。

圖6 外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜?？寡趸富钚缘挠绊慒ig.6 Effects of exogenous melatonin on antioxidant enzyme activities of leaves of alfalfa seedlings under drought stress注:A,超氧化物歧化酶活性;B,過氧化物酶活性;C,過氧化氫酶活性;D,抗壞血酸過氧化物酶活性Note:Panel A,Superoxide dismutase activity;Panel B,Peroxidase activity;Panel C,Catalase activity;Panel D,Ascorbate peroxidase activity

2.6 外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗抗氧化酶基因表達的影響

抗氧化酶合成基因在不同處理下呈現先升高后降低的趨勢,植物為了抵御和適應干旱脅迫造成的傷害,啟動干旱應答機制,激活抗氧化酶基因的表達。如圖7所示,與對照組相比,干旱顯著促進了編碼抗氧化酶基因的表達(P<0.05),褪黑素進一步提高了其表達,尤其是在90 μmol·L-1和120 μmol·L-1褪黑素處理時有最高表達。與干旱脅迫相比,120 μmol·L-1褪黑素處理紫花苜蓿幼苗MsCu/Zn-SOD表達上調25%(圖7A),MsCAT上調19%(圖7C),MsAPX上調36%(圖7D),90 μmol·L-1褪黑素處理紫花苜蓿幼苗MsPOD表達上調37%(圖7B)。

圖7 外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜?？寡趸负铣苫虮磉_的影響Fig.7 Effects of exogenous melatonin on gene expression of antioxidant enzymes in the leaves of alfalfa seedlings under drought stress注:A,MsCu/Zn-SOD表達水平;B,MsPOD表達水平;C,MsCAT表達水平;D,MsAPX表達水平Note:Panel A,MsCu/Zn-SOD expression level;Panel B,MsPOD expression level;Panel C,MsCAT expression level;Panel D,MsAPX expression level

3 討論

植物在應對干旱脅迫環境時,會發生一系列生理及形態的變化來維持自身的生存生長,如葉片卷曲、刺化,根系變長和氣孔關閉[26]。有研究發現施加褪黑素、2,4-表油菜素內酯、NO,IAA和獨腳金內酯等外源添加劑,可以達到對逆境脅迫下紫花苜蓿的生長和生理等方面的正向調控作用,有利于紫花苜蓿抵抗逆境脅迫[27-31]。本試驗中,干旱處理下紫花苜蓿幼苗植株矮小,葉片萎蔫、枯黃(圖1),葉片相對含水量和葉綠素含量顯著下降,干旱處理組紫花苜蓿幼苗株高、莖粗顯著低于CK,而根灌外源褪黑素可以顯著提高株高莖粗(圖2),葉片相對含水量上升且與對照組無顯著差異,葉綠素含量在褪黑素緩解下含量顯著提高(P<0.05)。這與He等[32]在2022的研究結論外源褪黑素能夠增加干旱脅迫下甜菜(BetavulgarisL.)地上、地下部分鮮重干重及株高的結果一致,即添加適宜濃度的褪黑素能夠有效改善干旱導致的植物生長受阻,促進植株吸水和葉綠素合成。李榮等[33]的研究也證明外源褪黑素增加了鹽脅迫下黃瓜(CucumissativusL.)幼苗的株高和莖粗。

干旱等非生物脅迫造成植物滲透失衡,抑制植物吸水,植物通過自身滲透調節,即增加滲透脅迫物質含量,降低滲透勢以維持細胞膨壓和保水?？扇苄蕴?、可溶性蛋白和脯氨酸在干旱脅迫下是重要的滲透調節物質。本研究中,干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量顯著上升,以抵御滲透失衡,添加外源褪黑素后,其含量逐漸降低,但顯著高于對照組,這是因為褪黑素在增強植物滲透調節物質積累的同時,提高了植物葉片相對含水量,緩解滲透脅迫,增強幼苗抗旱性。前人的研究中也有類似的報道,這與Ahmad等[34]研究得出外源褪黑素可顯著降低鹽脅迫下玉米(ZeamaysL.)葉片脯氨酸、可溶性糖含量的結果一致。根灌外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿的影響大多集中于對葉片的研究,根系是感知水分最敏感的器官,對根系進行生理分子方面的研究鮮見報道有待進一步研究。

持續干旱脅迫造成細胞ROS的產生和消除不平衡,導致細胞膜結構被破壞,對植物造成氧化損傷[35]。褪黑素誘導抗氧化酶活性,有助于維持ROS的平衡[36]。在干旱脅迫下,褪黑素處理的紫花苜蓿中抗氧化酶SOD,POD,CAT和APX的活性較高,中高濃度MT的作用效果更明顯(圖6)。對茶樹(CamelliasinensisL.)[37]和甜高粱(Sorghumbicolor)幼苗[38]的研究表明,MT通過增強抗氧化酶活性,從而提高了對干旱脅迫的抵抗力。干旱導致植株葉片細胞膜過氧化,膜透性增大,電解質和小分子物質外滲造成電導率升高,MDA作為膜脂過氧化的終產物,其含量能夠反應膜受損傷程度[39]。本研究發現干旱處理導致紫花苜蓿幼苗葉片H2O2、相對電導率、MDA含量增加;MT復合處理降低了H2O2,REC,MDA的含量(圖3),有效抑制了干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片中ROS的增加。本研究結果與褪黑素對獼猴桃(Actinidiachinensis)[40]和玉米[34]的影響相似。這表明MT誘導紫花苜蓿葉片中抗氧化酶活性的增加,以去除過量的ROS并保護植物免受氧化應激。此外,我們的試驗發現褪黑素增加了干旱脅迫下MsCu/Zn-SOD,MsPOD,MsCAT和MsAPX基因的表達量,這與Niu等[25]的研究結果一致,褪黑素抑制了因NaCl脅迫引起的細胞膜缺陷、脂質過氧化和活性氧(ROS)積累,MT上調抗氧化酶的基因表達和活性,以清除NaCl處理植物中過量的ROS。

4 結論

綜上所述,干旱阻礙紫花苜蓿正常生長,植物為抵御干旱損傷啟動自身防御機制,使抗氧化酶活性、滲透調節物質含量增加;外源褪黑素通過提高植物的抗氧化能力和滲透調節能力緩解由干旱引起的損傷,添加不同濃度(30,60,90,120,150 μmol·L-1)的褪黑素具有不同的緩解程度,其中90 μmol·L-1褪黑素溶液處理最佳,并可使丙二醛含量、可溶性糖含量、相對含水量緩解到對照水平,對植物生長生理及抗氧化酶基因表達等各方面具有明顯作用,顯著提高植物的抗旱性。田間生產應用時,在遇到水分脅迫的年際,可以通過根灌90 μmol·L-1褪黑素緩解牧草等植物的干旱生理脅迫,本研究對了解褪黑素對紫花苜蓿響應干旱脅迫的機制和田間應用具有一定理論意義。