微生物菌劑與氮肥配施對紫花苜蓿生長及土壤性質的影響

李青璞,白建海,姚 拓*,雷 楊,周 澤,張 琛,付衛剛

(1. 甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室,甘肅 蘭州 730070;2. 甘肅欣海牧草飼料科技有限公司,甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作為重要的豆科牧草,不僅具有廣泛適應性、極高的飼用及經濟價值[1],而且由于其獨特的氮利用方式,能夠固氮改土,也發揮出了較高的生態價值。此外與禾谷類牧草相比,紫花苜蓿的蛋白質含量較高。因此種植紫花苜蓿人工草地是解決畜牧業發展中蛋白飼料資源短缺的重要途徑和有效方法。我國苜蓿種植區域主要集中在北方地區,如甘肅、寧夏、內蒙古等地是我國苜蓿牧草的主產區[2]。甘肅河西地區作為我國西北地區紫花苜蓿優勢主產區,但因其地處內陸,常年降雨稀少,制約了牧草生產和發展,同時該地區土壤養分匱乏,部分地區的種植戶和種植企業為了提高紫花苜蓿牧草產量,施用了大量化肥[3]。有研究表明,施肥可提高苜蓿粗蛋白含量,降低中性和酸性洗滌纖維含量,提高相對飼喂價值[4],但持續施用化肥并不能帶來持續增產,相反會造成資源浪費,土壤質量降低等問題[5]。因此,這種經驗施肥不僅提高了生產成本也浪費了肥料,而利用微生物菌劑與化肥搭配施用可以減少化肥用量,節約成本。

近年來,微生物菌劑的研究與應用有了很大的突破,其中以植物根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria,PGPR)為主要成分研制的新型PGPR菌肥已成為國內外化肥替代物研究的熱點之一[6]。微生物菌劑是將有益的活性菌經過特殊的加工,制成便于使用的生物制劑或活菌制劑[7],具有改善作物營養狀況、調節植物的生長,提高土壤酶活性以及提升肥料利用率等功能,是提高作物產量和品質、促進農業可持續發展的重要途徑之一[8]。目前有關微生物菌劑與氮肥減量配施在設施作物領域研究較多,而對微生物菌劑與氮肥減量配施對紫花苜蓿生產和紫花苜蓿地土壤肥力的影響研究較少?；诖?本試驗在甘肅河西地區進行,研究微生物菌劑與氮肥減量配施對苜蓿草地生產力及土壤肥力特征的影響,以達到減少氮肥用量的同時促進植物生長發育及提高土壤肥力特性,為河西地區牧草生產提供科學合理的施肥量。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為‘驚盛’紫花苜蓿,由甘肅欣海牧草科技有限公司提供;供試菌株(表1)來源于甘肅農業大學草業學院草地微生物實驗室。

表1 供試菌株Table 1 Strains for test

1.2 試驗設計

1.2.1試驗區概況 試驗地位于甘肅省武威市民勤縣(甘肅欣海牧草科技有限公司,103°35′E,39°08′N),屬溫帶大陸性干旱荒漠氣候,平均海拔1 400 m,年平均氣溫8.8℃,年平均降水量為115 mm,年蒸發量2 646 mm;該地區太陽輻射強,光照充足;無霜期較短,極端最低氣溫-29.5℃,極端最高氣溫41.7℃,晝夜溫差大。土壤類型為灌漠土,土壤質地偏砂,pH值8.28,鹽分含量0.41%,有機質含量0.4%,全氮含量0.52 g·kg-1,全磷含量0.44 g·kg-1。

1.2.2試驗設計 氮肥減量配施試驗于2022年8月第一茬紫花苜蓿收割后施入。全量氮肥施用量為150 kg·hm-2,所用氮肥為尿素(含N 46%)。采用大田小區試驗,設置7個施肥水平,如表2所示,每處理3個重復,共設21個小區。試驗小區面積為5 m×4 m=20(m2),為減少試驗誤差,各小區之間以1 m的小田埂將其隔開。其中根瘤菌劑(GAU-123)施用量為4.5 L·hm-2,促生菌劑為一株根瘤菌和兩株芽孢桿菌的組合(GAU-123+Y1+Y3),施用量為根瘤菌2.25 L·hm-2、兩株芽孢桿菌分別為1.125 L·hm-2,播種前按上述用量拌種。試驗田于2022年5月建植,人工條播,播種量為18 kg·hm-2,播種行距為30 cm,播種深度為2 cm,田間管理除施肥外,其他灌溉、除草、病蟲害防治等按照當地高產苜蓿田統一進行管理。

表2 試驗處理Table 2 Test treatments

1.2.3菌劑制備 Y1、Y3采用LB液體培養基(10 g·L-1NaCl、10 g·L-1胰蛋白胨和 5 g·L-1酵母粉,將pH調節為7.0),GAU-123采用YMA液體培養基(甘露醇10 g·L-1、酵母粉3 g·L-1,Mg SO40.2 g·L-1,NaCl 0.1 g·L-1,K2HPO40.25 g·L-1,KH2PO40.25 g·L-1),進行培養。以上液體培養基均用立式壓力蒸汽滅菌鍋在 121℃下對培養基滅菌 20 min;冷卻后,在超凈工作臺上加入菌液,每100 mL的LB液體培養基分別添加100 μL的母液;在28℃,150 r·min-1條件下的恒溫培養搖床培養48 h后,使用紫外可見分光光度計測定菌液濃度,調節濃度一致[9-10],三種菌株均OD600 ≥0.5,通過平板涂布,計算后活菌數均約為108CFU·mL-1。

1.3 測定指標及方法

在紫花苜蓿初花期測定其株高,每個小區選取10株長勢相近的植株,用卷尺測植物基部到頂端的長度,精確到0.1 cm;在紫花苜蓿初花期,每個小區分別取1 m × 1 m的樣方刈割測產,留茬5 cm,刈割后立即稱其鮮重,選取300 g鮮草帶回實驗室于烘箱內105℃殺青30 min,后調至65℃烘至恒重,計算干鮮比,換算為單位面積干草產量;將用于測定產量的草樣粉碎備用。土壤樣品于初花期(2022年10月9日)紫花苜蓿刈割后采集,利用鐵鍬挖出完整的苜蓿根,抖落根系大塊土壤板結,收集附于根上0～5 mm的土壤。參考《飼料分析及飼料質量檢測技術》測定粗蛋白(Crude protein,CP)、粗脂肪(Ether extract,EE)、中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)含量[11],并計算飼草相對飼喂價值(Relative feed value,RFV)[12];土壤全量養分等參照《土壤農化分析》[13]測定;采用蘇州格銳思生物科技有限公司試劑盒測定土壤過氧化氫酶、土壤脲酶、土壤蔗糖酶、土壤堿性磷酸酶活性。

1.4 數據分析

采用Excel 2019對數據進行整理,利用SPSS 26.0統計軟件進行方差分析,對不同施肥處理下的植株株高、生物量、土壤理化性質、土壤酶活性采用單因素方差分析(One-way ANOVA),顯著水平為P<0.05,用Origin 2021繪制圖表。

利用模糊數學隸屬函數法計算各處理所選指標的隸屬函數值,并將所選指標隸屬函數值求和,再取均值,以均值大小進行排名,均值越大,排名越靠前。隸屬函數計算公式[14]:

R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中,R(Xi)表示某指標隸屬函數值,Xi表示該指標的測定值;Xmax表示該指標最大值;Xmin表示該指標最小值。若測定指標與牧草的營養價值呈正相關關系,則用式(1)計算;若呈負相關關系,則用式(2)計算。

2 結果與分析

2.1 微生物菌劑與氮肥配施對紫花苜蓿株高和產量的影響

不同施肥處理下,紫花苜蓿株高和干草產量如圖1所示。各個施肥處理之間紫花苜蓿株高無顯著差異,株高范圍在55.1～60.1 cm之間,其中C7,G7,G6處理下紫花苜蓿株高與其他處理相比較低;與CK相比,接種微生物菌劑和氮肥減量處理下的紫花苜蓿干草產量無顯著差異。

圖1 不同施肥處理的紫花苜蓿產量和株高Fig.1 Yield and plant height of alfalfa under different fertilization treatments注:誤差線為標準誤。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下圖同Note:The error line is standard error. Different lowercase letters indicate distinct differences,the same as below

2.2 微生物菌劑與氮肥配施對紫花苜蓿營養品質的影響

不同施肥處理下紫花苜蓿營養品質和相對飼用價值如表3所示。粗蛋白和粗脂肪含量表現為隨施氮量減少而下降的趨勢,其中C6,G6處理下的粗蛋白均顯著低于其他處理(P<0.05),G7處理下的粗蛋白含量為17.01%,較高于其他施肥處理;G6處理下的粗脂肪含量則顯著低于其他施肥處理(P<0.05),其中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維顯著高于其他施肥處理(P<0.05);通過計算相對飼用價值發現,CK,G8,C7,G7處理下的相對飼用價值顯著高于C6,G6處理(P<0.05),其中CK處理的相對飼用價值最高,達到200.95,C7次之為193.54。

表3 不同施肥處理的紫花苜蓿營養品質和相對飼用價值Table 3 Nutritional quality and relative feeding value of alfalfa under different fertilization treatments

2.3 微生物菌劑與氮肥配施對土壤理化性質的影響

不同施肥處理下土壤理化性質如圖2所示。不同施肥處理對土壤速效磷含量無顯著影響;與CK相比,C8處理顯著增加了土壤硝態氮含量,達到2.14 mg·kg-1(P<0.05),其余接種和施氮處理無顯著差異,除G6處理外,其余各接種和施氮處理的土壤銨態氮含量顯著高于CK(P<0.05),其中G8處理下的土壤銨態氮含量最高,達到 0.57 mg·kg-1;不同施肥處理間的土壤速效磷、有機質、含水率和pH值與CK相比無顯著差異;接種促生菌與氮肥減量40%降低了土壤全氮含量;與CK相比各處理間的土壤電導率差異顯著(P<0.05),其中G8,C6處理下土壤電導率低于其他處理。

圖2 不同施肥處理的土壤理化性質Fig.2 Soil physicochemical properties under different fertilization treatments

2.4 微生物菌劑與氮肥配施對土壤酶活的影響

不同施肥處理下土壤酶活性如圖3所示。各施肥處理間的土壤過氧化氫酶和蔗糖酶活性無顯著差異,與CK相比,各接種微生物菌劑與氮肥減量處理的土壤過氧化氫酶活性均有所升高,升高范圍在5.59%～14.98%;C8,G7處理下的土壤堿性磷酸酶活性顯著高于其他處理,較CK提高了19.48%和44.70%(P<0.05);各接種微生物菌劑與氮肥減量處理的土壤脲酶活性均顯著低于CK,降低范圍在9.76%～76.36%(P<0.05)。

圖3 不同施肥處理的土壤酶活性Fig.3 Soil enzyme activities under different fertilization treatments

2.5 紫花苜蓿生長和營養品質與土壤理化性質相關性分析

如圖4所示,苜蓿粗蛋白、粗脂肪與相對飼用價值極顯著正相關(P<0.01),苜蓿中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維與相對飼用價值極顯著負相關(P<0.01),苜蓿粗蛋白、粗脂肪與中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維極顯著負相關(P<0.01);土壤堿性磷酸酶與土壤脲酶極顯著正相關(P<0.01),土壤含水率與土壤速效磷、土壤電導率極顯著正相關(P<0.01),土壤堿性磷酸酶與酸性洗滌纖維極顯著負相關(P<0.01)。

圖4 各指標間的相關性分析Fig.4 Correlation analysis between indicators注:*和**分別表示在0.05和0.01水平上的差異顯著Note:* and ** indicate significant differences at the 0.05 and 0.01 levels respectively

2.6 隸屬函數綜合分析

采用模糊數學隸屬函數法對不同施肥處理的紫花苜蓿生長營養指標和土壤指標進行分析,結果表明(表4),在所有處理中,G7處理表現最好,平均隸屬函數值為0.59,其次為G8處理,平均隸屬函數值為0.53,C7處理平均隸屬函數值小于0.42,綜合表現較差。

表4 不同施肥處理的綜合評價Table 4 Comprehensive evaluation under different fertilization treatments

3 討論

3.1 微生物菌劑與氮肥配施對紫花苜蓿生長及營養品質的影響

研究表明氮肥是限制牧草生產的重要因素之一,施用氮肥可以有效提高牧草的產量[15]。目前關于苜蓿在種植過程中是否需要添加額外的氮肥以及氮肥施用量的大小來提高紫花苜蓿的干草產量這一關鍵問題上仍存在不同觀點,部分觀點認為苜?？梢耘c根瘤菌共生固氮以滿足苜蓿生長的需要,因此,氮肥的添加并不會對苜蓿的生長有促進作用[16],另一部分觀點認為在苜蓿生長初期及衰老期苜蓿根瘤菌固氮酶活性較弱,添加外源氮可以提高苜蓿的干物質產量[17]。由微生物菌劑制作成的菌肥來替代部分化肥是實現化肥減量的重要技術途徑之一,近年來在農業中的應用也備受重視[18]。本研究中,接種微生物菌劑與氮肥減量處理下的紫花苜蓿株高和產量與CK相比無顯著差異,說明接種微生物菌劑替代部分氮肥未降低紫花苜蓿產量。因此在首年建植的苜蓿田中可以有效減少氮肥施用量從而增加經濟效益。施用微生物菌劑可以改善土壤結構,促進植株根系生長,從而促進植株地上部的生長能力,同時減少化肥使用量。韓華雯等[19]研究發現,復合菌種接種劑+半量磷肥處理的苜蓿生長效果最佳,其苜蓿株高和產量分別較對照增加9.00%和11.98%;劉青海[20]的研究表明,混合接種菌劑處理促生效果更好,其中Jm92+Lx22+S11+G處理下的地上植物量較對照提高121.21%,極大的提高了苜蓿地上生物量。

牧草的粗蛋白、粗脂肪含量、NDF和ADF含量是評價優質飼草的重要指標,而這與科學合理的施肥息息相關。研究表明,施用氮肥顯著提高了牧草的粗蛋白含量[21],有效降低紫花苜蓿的NDF和ADF含量,改善牧草品質[22],利用復合菌劑處理替代半量化肥,紫花苜蓿的干草產量、粗蛋白和粗脂肪含量分別較CK提高10.6%,16.4%和 4.2%[23]。本研究中,當接種微生物菌劑與氮肥減量20%和30%時,未降低紫花苜蓿的粗蛋白、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量和相對飼用價值,接種微生物菌劑與氮肥減量40%時,其上述營養指標均顯著降低,說明接種微生物菌劑可以替代20%～30%的氮肥施用量而不降低紫花苜蓿的營養品質。王瑞峰等[24]通過添加根瘤菌和不同施氮量發現,中等施肥水平及接種根瘤菌可顯著提高苜蓿地上生物量,且接種根瘤菌可降低苜蓿莖葉中纖維素的含量。

3.2 微生物菌劑與氮肥配施對土壤理化性質與土壤酶活性的影響

土壤理化性質是影響土壤肥力的重要因素,同時綜合反映了土壤質量水平[25],也可表征土壤生產能力的大小。土壤可被植物吸收利用的無機氮素包括硝態氮和銨態氮兩種形式,因此常被作為土壤氮素供應水平的重要指標[26]。本研究結果顯示,與CK相比接種微生物菌劑與氮肥減量處理未降低土壤中銨態氮和硝態氮含量,且在C8處理下的硝態氮含量顯著高于CK,銨態氮含量除G6處理外,其他處理均高于CK,且不同施肥處理的土壤速效磷含量無顯著差異。這表明接種微生物菌劑對提高土壤中有效性氮含量有一定作用。有研究表明施44 kg·hm-2氮肥能增加0～15 cm土層的全氮含量,而對15 cm以下土層的全氮含量沒有影響,且每茬刈割后施氮肥不會造成苜蓿地下硝態氮的積累[27]。土壤有機質的數量和質量決定了土壤質量的好壞除為植物提供不同養分外,還可以反映土壤的肥力[28]。本研究中,與CK相比,接種微生物菌劑與氮肥減量處理的土壤有機質含量差異不顯著,表明氮肥減量未降低土壤有機質含量,這可能是由于施用微生物菌劑后增加了土壤中有益微生物的數量,提高了土壤質量。土壤養分的有效性受土壤pH值的干擾,且植物根系對養分的吸收也會受此影響,相關研究表明,土壤中氮的施入會加速土壤的酸化,因為土壤中的淋溶、硝化作用以及植物對陰陽離子的吸收不均衡都有可能造成土壤酸化[29-30]。此外,施用生物菌肥也可能導致土壤pH值下降,土壤中的微生物菌群在分解有機物的過程中產生的酸類物質和呼吸放出的二氧化碳與水形成的碳酸在土壤中積累可能會造成土壤pH值降低[31]。

土壤酶活性被認為是土壤肥力的一種傳感器,它們直接參與土壤中物質的轉化以及養分的釋放和固定,并且與土壤養分的供應密切相關,土壤酶活性水平反映了土壤中的微生物活性和生化反應,通常被用作反映微生物活性和土壤肥力的指標。本研究表明,紫花苜蓿根際土壤脲酶和堿性磷酸酶活性具有相關性,主要是因為土壤堿性磷酸酶和脲酶是土壤中的重要成分,其活性與土壤磷和氮的代謝密切相關[32],氮肥減量處理下的土壤脲酶活性低于CK,而C8,G7處理下的土壤堿性磷酸酶活性高于CK,這可能是由于微生物對施氮反應不同所致,氮的添加可以通過抑制終產物或微生物同化形成的產物增加土壤中產脲酶微生物的數量[33],施氮增強了土壤脲酶活性,同時減少土壤中氮限制,從而增加微生物數量來改善紫花苜蓿地下部生長狀況,促進紫花苜蓿生長[34]。Chibeba等[35]通過慢生根瘤菌單接種和根瘤菌與固氮螺旋菌共接種試驗,發現共接種并沒有增加籽粒產量,因此需要進一步研究有效的共接種菌種來探究多功能菌種共接種在生產上的限制因素;黃秋良等[36]研究了褐球固氮菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌不同接種量組合對芳樟生長的影響,發現不同接種量會影響接種效果;趙宇賓等[37]研究發現,膠質芽孢桿菌與阿氏芽孢桿菌分別接種都具有良好的促生效果,但混合接種卻沒有取得更高的共生固氮效率。本研究中促生菌和根瘤菌共接種且減氮30%的處理效果并沒有高于單接根瘤菌且減氮30%處理,可能是由于菌劑配比,菌間代謝物的互相影響所致,此外土壤作為一個復雜的生態體系,微生物功效的發揮也取決于它的數量、與土著微生物的競爭力以及土壤有機質等含量的高低[38],且豆科植物根系中可以分離出根瘤菌,因此添加根瘤菌劑可能在豆科植物根系定殖較為容易。

4 結論

與施用全量氮肥相比,接種微生物菌劑與氮肥減量20%～30%處理未降低紫花苜蓿的株高、干草產量和營養品質,且通過對不同施肥處理的紫花苜蓿生長、營養和土壤指標的綜合分析,綜合表現最好的為G7(即接種根瘤菌與氮肥減量30%)處理,有利于減少河西地區氮肥施用量,為河西地區紫花苜蓿的科學施肥提供依據。