柱花草SgPAL3基因啟動子的克隆及上游轉錄因子的篩選

戴镕徽 高夢澤 王芳 蔣凌雁 羅麗娟

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.01.007

引用格式：

戴镕徽， 高夢澤， 王? 芳，等.柱花草SgPAL3基因啟動子的克隆及上游轉錄因子的篩選［J］.草地學報，2024，32（1）：66-74

DAI Rong-hui， GAO Meng-ze， WANG Fang，et al.Cloning of SgPAL3 Gene Promoter and Screening of Upstream Transcription Factors in Stylosanthes［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（1）：66-74

收稿日期：2023-08-14；修回日期：2023-10-02

基金項目：國家自然科學基金項目（32201449，31872409）；海南大學協同創新中心項目（XTCX2022NYC02）；海南省自然科學基金高層次人才項目（320RC466）；海南省科技專項（ZDYF2020211）資助

作者簡介：

戴镕徽（1999-），女，漢族，黑龍江富錦人，碩士研究生，主要從事抗病相關基因克隆與功能研究，E-mail：dairh1999@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：lyjiang@hainanu.edu.cn

摘要：柱花草（Stylosanthes spp.）是熱帶地區廣泛種植的重要草種，炭疽病是危害柱花草的嚴重病害，柱花草SgPAL3基因具有抗炭疽菌的功能。本研究對啟動子區域-2 000～0 bp，-1 500～0 bp序列分別構建誘餌載體并檢測自激活，結果表明500 ng·mL-1金擔子素（Aureobasidin A，AbA）可以抑制兩種誘餌載體的自激活。利用Gateway技術構建了柱花草響應炭疽菌的酵母cDNA文庫，其容量為1.20×107，插入片段主要分布在750～2 000 bp，重組率為100%；利用酵母單雜交技術，篩選與SgPAL3基因啟動子互作的轉錄因子，并驗證了3個轉錄因子（SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8）與SgPAL3啟動子的互作關系；qRT-PCR分析表明，SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8均響應炭疽菌的侵染，說明它們可能調控柱花草對炭疽病的抗性。本研究為進一步解析SgPAL3響應炭疽菌侵染的轉錄調控機制奠定了基礎。

關鍵詞：柱花草；啟動子；酵母單雜；轉錄因子；SgPAL3基因

中圖分類號：Q943.2??? 文獻標識碼：A????? 文章編號：1007-0435（2024）01-0066-09

Cloning of SgPAL3 Gene Promoter and Screening of Upstream

Transcription Factors in Stylosanthes

DAI Rong-hui1，2， GAO Meng-ze1，2， WANG Fang1，2， JIANG Ling-yan1，2*， LUO Li-juan1，2

（1.School of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan Province 570228， China;

2.Sanya Institute of Breeding and Multipication， Hainan University， Sanya， Hainan Province 572025， China）

Abstract：Stylosanthes （stylo） is an important leguminous forage widely grown in tropical areas. Anthracnose is a serious disease affecting the growth of stylo. Previous studies show that SgPAL3 gene of stylo has function in the resistance against Colletotrichum gloeosporipides. In this study，the promoter regions of -2 000 to 0 bp and -1 500 to 0 bp were cloned into bait vectors，and the concentration of AbA that can inhibit the self-activation of bait vectors was determined. The results showed that 500 ng·mL-1 （Aureobasidin A，AbA） inhibited the self-activation of both bait vectors. The yeast cDNA library of stylo in response to C. gloeosporioides infection was constructed using the Gateway technology. The capacity of the library was 1.20×107. The inserted fragments were mainly distributed from 750 to 2 000 bp，and the recombination rate was 100%. The transcription factors interacting with SgPAL3 gene promoter were screened by yeast one-hybrid technique，and the the interactions of three transcription factors （SgASIL2，SgHAT5 and SgZHD8） with the SgPAL3 promoter were verified by yeast point-to-point experiments. The qRT-PCR analysis showed that the expression of SgASIL2，SgHAT5 and SgZHD8 were all responsive to C. gloeosporioides infection，indicating the these three transcription factors involved in regulating the defense responses of stylo against C. gloeosporioides. These results would lay a foundation for further research on transcriptional regulation mechanisms of SgPAL3 in response to C. gloeosporioides infection.

Key words：Stylosanthes;Promoter;Yeast one-hybrid;Transcription factors;SgPAL3 gene

柱花草是重要的熱帶豆科牧草，因適應性強、產草量高等優良特性，還被廣泛用于綠肥和熱區林果草生態工程建設等［1-3］。由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporipides）引起的炭疽病是危害柱花草生產的嚴重病害［4］。苯丙烷途徑是植物體內最重要的次生代謝途徑之一，可以產生多種重要的次生代謝產物［5］。其中，苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）是苯丙烷類代謝途徑的第一個關鍵酶，廣泛存在于高等植物和微生物中，并在植物的生長發育和抗病過程中起重要作用［6］。作者團隊前期通過對超量表達SgPAL3擬南芥（Arabidopsis thaliana）植株接種膠孢炭疽菌的病癥表型觀察、膠孢炭疽菌在植株內表達量和侵染進程檢測，表明超量表達SgPAL3增強了植株對炭疽菌的抗病性，暗示著柱花草SgPAL3基因在柱花草抗炭疽病過程中發揮著重要作用［7］。但是，目前有關SgPAL3基因功能在分子水平上的調控機制鮮有報道，與SgPAL3基因互作蛋白也有待挖掘。

酵母單雜交（Yeast one-hybrid system，Y1H）是在酵母體內研究轉錄因子和啟動子之間相互作用的技術［8］。目前，已通過該項技術在煙草（Nicotiana tabacum）、水稻（Oryza sativa）等模式植物中篩選出可以調控目的基因的轉錄因子，但在柱花草中應用該技術較少［9-10］。

為篩選與SgPAL3基因啟動子結合的轉錄因子，解析柱花草PAL基因的分子調控機制，本研究從‘熱研5號柱花草（Stylosanthes guianensis ‘Reyan No.5）基因組中克隆SgPAL3基因的啟動子序列，并對啟動子區域-2 000～0 bp，-1 500～0 bp序列分別構建誘餌載體，利用酵母單雜交技術篩選并驗證了與SgPAL3啟動子互作的轉錄因子。研究結果為深入研究SgPAL3基因的轉錄調控機制提供了基礎，也為柱花草抗病品種選育提供了實驗依據。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料及試劑

植物材料為苗齡1個月的‘熱研5號柱花草葉片。

菌種為膠孢炭疽菌強致病菌DZ-19和弱致病菌WC-02，由作者團隊篩選保存［11］。

產物純化、質粒提取試劑盒購自諾唯贊生物科技（南京）股份有限公司。限制性內切酶Kpn Ⅰ，Xho Ⅰ和Bstb I購于NEB（美國）有限公司，T4連接酶購于Thermo Fisher（美國）有限公司。酵母培養所需的酵母氮源培養基（Yeast Nitrogen Base，YNB）購于索萊寶科技（北京）有限公司。金擔子素（AbA）和缺陷型培養基（Do Supple ment/-Ura，SD/-Ura，Do Supplement/-Leu，SD/-Leu）購自酷來搏科技（北京）有限公司。

柱花草cDNA文庫由歐易生物醫學科技（上海）有限公司構建。酵母單雜交菌株Y1H Gold、誘餌載體pAbAi及Prey載體pGADT7均由歐易生物醫學科技（上海）有限公司提供，試驗所用引物均由北京擎科生物科技有限公司完成（表1）。測序由楠山生物技術（?？冢┯邢薰就瓿?。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 柱花草SgPAL3基因啟動子的克隆及順式作用元件分析? 根據SgPAL3基因啟動子序列，分別截取起始密碼子5方向上游1 500 bp和2 000 bp作為SgPAL3基因啟動子候選序列，使用Oligo 7設計上下游引物并分別引入Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ限制性內切酶位點。提取‘熱研5號柱花草的基因組DNA作為模板，pAbAi-SgPAL3-A/B-F，pAbAi-SgPAL3-R為引物（表1），使用高保真DNA聚合酶2 × Phanta Max Master Mix進行PCR擴增得到SgPAL3基因啟動子。反應程序為95℃ 3 min，95℃ 15 s，53℃ 15 s，72℃ 80 s，32個循環。

利用在線分析軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/plantcare/html/），預測SgPAL3基因啟動子區域的順式作用元件。

1.2.2? 誘餌載體的構建及轉化酵母Y1H Gold? 用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ酶對載體pAbAi和SgPAL3啟動子的純化片段分別進行雙酶切，用T4連接酶在16℃過夜連接。將連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆送至公司進行測序。獲得誘餌載體pAbAi-SgPAL3，并將重組誘餌載體分別命名為pAbAi-SgPAL3-A，pAbAi-SgPAL3-B。

用Bstb I酶線性化誘餌載體pAbAi-SgPAL3-A，pAbAi-SgPAL3-B。將1 μg純化后的線性化載體轉入Y1H酵母感受態細胞中，涂布于SD/-Ura平板上，28℃培養3～5 d后挑取單菌落，使用pAbAi-F/R（表1）為檢測引物進行PCR鑒定。若擴增出一段條帶約0.39 kb+insert size的片段，則表明誘餌載體成功整合到酵母Y1H Gold基因組中，即為誘餌菌株Y1H［pAbAi-SgPAL3-A］，Y1H［pAbAi-SgPAL3-B］。

1.2.3? 誘餌酵母菌株對AbA敏感性的檢測? 從SD/-Ura平板上挑取鑒定為陽性的酵母單菌落，置于SD/-Ura液體培養基中28℃，200 r·min-1振蕩培養；使用ddH2O重懸至OD600=0.002（即每100 μL重懸液中包含2 000個細胞），各取100 μL上述菌液涂布在含有不同AbA濃度的SD/-Ura培養基上，AbA質量濃度分別為0，100，200，300，400，500 ng·mL-1，28℃培養3 d，根據酵母菌落的生長情況確定抑制誘餌菌株生長所需的最小AbA質量濃度。

1.2.4? 酵母cDNA文庫的構建? 采用全株噴灑孢子懸浮液的方式對1月齡‘熱研5號柱花草分別噴灑膠孢炭疽菌DZ-19和WC-02，提取接種后0，24，48，60，96小時（hours post inoculation，hpi）的10種樣品RNA，并等量混勻，委托歐易生物醫學科技（上海）有限公司通過Gateway技術構建酵母cDNA文庫。

1.2.5? 酵母單雜交cDNA文庫的篩選及測序分析? 根據歐易生物醫學科技（上海）有限公司提供的說明書進行酵母單雜篩庫實驗。將次級酵母文庫質粒10 μg分別轉化到誘餌酵母菌株Y1H［pAbAi-SgPAL3-A］，Y1H［pAbAi-SgPAL3-B］感受態細胞里，取轉化后的重懸菌液100 μL，涂布到含有相應濃度AbA的SD/-Leu固體培養基上，28℃恒溫培養3～5 d，單克隆長出至大小1～2 mm，初篩完成；將初篩平板上長出的陽性克隆轉移到同樣的篩選培養基SD/-Leu/AbA*上，進行二次篩選。挑取生長較大的陽性克隆進行PCR鑒定，使用表1檢測引物3AD/T7進行PCR鑒定，PCR產物送至公司進行測序。將測序序列在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行Blast比對，結合接種膠孢炭疽菌的柱花草轉錄組學數據分析［4］及Nr同源物種注釋結果對其進行功能注釋，并在CDD網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）中進行保守結構域的預測。

1.2.6? 候選轉錄因子的酵母單雜交驗證? 根據轉錄組測序的轉錄本序列，獲得候選轉錄因子全長cDNA序列。通過PCR擴增候選轉錄因子的全長，利用同源重組的方法構建到pGADT7載體上，正反向引物序列見表1。

提取候選轉錄因子的質粒，將誘餌酵母制備成感受態細胞，通過共轉的方式將質粒轉化至酵母感受態中，使用3AD/T7（表1）為檢測引物進行PCR鑒定；挑取陽性克隆，接種于SD/-Leu液體培養基于28℃搖床擴繁。使用ddH2O將菌液按照1∶10，1∶100，1∶1 000稀釋后，分別點于SD/-Leu和SD/-Leu/AbA*平板，倒置于28℃培養箱3～5 d，觀察生長情況。

1.2.7? 候選基因qRT-PCR鑒定? 為了明確候選轉錄因子在接種膠孢炭疽菌后的表達特性，對1月齡‘熱研5號柱花草噴灑接種膠孢炭疽菌DZ-19，提取接種后0，24，48，60，72，96 hpi的樣品RNA，采用Vazyme公司的反轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA，用Oligo 7設計目的基因的引物（表1），以UBCE1為內參基因，進行qRT-PCR檢測。采用2-△△Ct方法計算各基因的相對表達量。

2? 結果與分析

2.1? 柱花草SgPAL3基因的克隆和序列分析

以‘熱研5號柱花草葉片的DNA為模板，擴增SgPAL3基因的啟動子序列。結果如圖1所示，擴增的條帶大小分別約為2 000 bp和1 500 bp。將所克隆的片段回收后連接到pAbAi載體上，挑選陽性克隆送至公司進行測序。構建完成的重組質粒測序結果與目的序列一致，相似性達100%。根據測序獲得的啟動子序列，利用在線網站PlantCARE對SgPAL3啟動子進行順式作用元件分析。表2結果表明，在SgPAL3啟動子區中含有核心啟動子元件TATA-box，CAAT-box，植物激素響應元件ERE，TCA-element，ABRE，AAGAA-motif，光響應元件Box-4，G-box，LAMP-element，環境脅迫響應元件ARE，WUN-motif，分生組織表達調節元件CAT-box，細胞周期結合元件MSA-like以及MYB，MYC轉錄因子結合元件。但是，僅在2 000 bp的SgPAL3啟動子中發現了WRKY轉錄因子結合元件W-box。

2.2? 誘餌載體的構建及酵母菌株的轉化

用載體引物對轉入誘餌載體的單菌落進行菌落PCR驗證，得到與目的基因大小一致的條帶，如圖2A所示。將對應菌液送至公司進行測序，測序結果與目的片段一致，表明上述誘餌載體構建成功。

將構建好的誘餌載體pAbAi-SgPAL3-A，pAbAi-SgPAL3-B用Bst BI單酶切鑒定，酶切后的質粒與原質粒的條帶大小存在差異，如圖2B所示，說明成功獲得線性化載體?；厥誂中的線性化載體并轉入Y1H Gold酵母菌感受態細胞中，使用通用引物對單菌落進行菌落PCR驗證，如圖2C所示，酵母單菌落中分別含有約2.39 kb（2.0 kb+0.39 kb）和一段約1.89 kb（1.5 kb+0.39 kb）的片段，說明誘餌載體成功轉入酵母基因組，成功獲得了酵母誘餌菌株Y1H［pAbAi-SgPAL3-A］，Y1H［pAbAi-SgPAL3-B］。

2.3? AbA抗性篩選

挑取上述兩種酵母菌株的陽性菌落，用ddH2O重懸細胞，直至OD600=0.002，分別涂布于含AbA濃度0，100，200，300，400，500 ng·mL-1的SD/-Ura培養基上。檢測結果如圖3所示，轉化菌株在100 ng·mL-1 AbA培養基上生長良好，而在500 ng·mL-1 AbA培養基上完全停止生長，說明500 ng·mL-1可用于酵母單雜篩選。

2.4? 酵母cDNA文庫的構建與質量檢測

采用接種膠孢炭疽菌后的柱花草葉片構建了酵母cDNA文庫（圖4A），庫容量為1.20×107。隨機挑取24個克隆進行菌落PCR鑒定，插入片段主要分布在750～2 000 bp，重組率為100%，結果如圖4B所示，說明文庫質量較好，且符合篩庫標準。

2.5? SgPAL3啟動子片段與柱花草cDNA文庫的酵母單雜篩選

在SD/-Leu/AbA（500 ng·mL-1）平板初篩中，Y1H［pAbAi-SgPAL3-A］共獲得198個的陽性酵母菌落，Y1H［pAbAi-SgPAL3-B］共獲得68個陽性酵母菌落。劃線二次培養后，使用通用引物進行陽性克隆的PCR檢測，PCR產物送至公司進行測序，結果如圖5所示，Y1H［pAbAi-SgPAL3-A］共得到132條序列，Y1H［pAbAi-SgPAL3-B］共得到42條序列。

在NCBI上對測序結果進行Blast比對，并結合柱花草響應炭疽菌侵染的轉錄組學數據和Nr同源物種的注釋信息，共獲得了83個候選基因。將候選基因的核酸序列在CDD網站進行保守結構域分析，共篩選到3個基因具有典型的DNA結合域，預測為轉錄因子（表3），分別為Trihelix家族的ASIL2、HD-Zip家族的HAT5和ZF-HD家族的ZHD8。

2.6? 酵母單雜交驗證

為了驗證SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8是否與SgPAL3-A啟動子存在互作關系，將誘餌載體SgPAL3-A分別與3個轉錄因子構建的酵母表達載體共轉化后觀察酵母細胞的生長情況。結果如圖6所示，在SD/-Leu培養基上，誘餌酵母細胞均能生長，說明AD質粒已轉入誘餌酵母細胞；在添加了500 ng·mL-1 AbA的SD/-Leu培養基上，陽性對照和3個候選轉錄因子均能正常生長，陰性對照不生長，表明SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8與SgPAL3-A啟動子區存在互作關系。

2.7? 候選基因熒光定量表達分析

為確定轉錄因子SgASIL2、SgHAT5和SgZHD8是否響應炭疽菌的侵染，以接種膠孢炭疽菌后0，24，48，60，72和96 hpi‘熱研5號柱花草葉片的cDNA為模板，通過qRT-PCR技術檢測其相對表達量，結果如圖7所示，在接種膠孢炭疽菌后，SgASIL2的相對表達量呈現整體下調的趨勢，SgHAT5和SgZHD8的相對表達量則呈現先降低、后升高、再降低的趨勢，并在60 hpi達到峰值。以上結果表明，SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8均對炭疽菌的侵染有響應，推測它們可能為SgPAL3啟動子響應炭疽菌的調控因子。

3? 討論

研究發現，大量的轉錄因子參與植物苯丙烷的代謝調控，不同類型的轉錄因子可分別結合到PAL，C4H及4CL等基因的啟動子區，激活或抑制其表達［9，12］。轉錄調控依賴于順式作用元件和反式作用因子的協調作用，是植物基因表達調控中的重要環節［13-14］。順式作用元件具有序列和功能保守型，如TCA-element，ABRE，TGACG-motif是植物激素生長素、脫落酸、茉莉酸甲酯的響應元件，MBS，ARE，LTR是植物干旱響應、厭氧誘導、低溫脅迫相關的響應元件［15］。轉錄因子通過與各種生物及非生物脅迫應答基因啟動子區的順式作用元件相互作用，調控下游逆境脅迫應答靶基因的表達，使植物適應各種逆境［16］。如植物轉錄因子可以與靶基因啟動子結合，激活或抑制其表達，從而參與激素介導的抗病反應［17］。SgPAL3在柱花草接種炭疽菌后顯著上調，超量表達SgPAL3的植株對炭疽菌的抗病性增強，預示SgPAL3是柱花草抗炭疽菌的正調控因子［18］。本研究對SgPAL3基因上游2 000 bp和1 500 bp啟動子區域的順式作用元件進行了預測（表2），表明其可能在植物抵御病原菌侵染、生長發育、響應激素信號分子的刺激等生物過程中發揮作用。為了進一步探究SgPAL3受哪些轉錄因子的調控，本研究通過構建響應炭疽菌侵染的酵母cDNA文庫、單雜交技術篩庫和點對點實驗（圖4～6），證明了SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8與SgPAL3的2 000 bp啟動子區域存在互作關系。

ASIL2屬于Trihelix家族，該基因家族既調控植物的生長發育，又能幫助植物響應逆境脅迫［19-20］。Ruiz等［21］研究發現，ASIL1及其同源基因ASIL2可能參與營養階段對某些生物和非生物脅迫的反應。ASIL2基因負調控番茄（Solanum lycopersicum）對干旱和鹽脅迫的適應性［22］。HAT5屬于HD-Zip家族，番茄中過表達PsHAT5增強了番茄的耐旱耐鹽性和低溫敏感性［23］，吉林人參（Jilin Ginseng）中HD-Zip家族的表達模式存在時空特異性，目前無生物脅迫方面的報道［24］。ZHD8屬于ZF-HD家族，該基因家族在植物生長發育、非生物響應和生物脅迫過程中起到重要的調控作用［25］。Wang等［26］研究發現，葡萄（Vitis vinifera L.）在接種白粉菌（Erysiphe necator）后，多數VvZHD基因表達下調，如VvZHD1，4，8和12。黃瓜在接種白粉菌（Sphaerotheca fuliginea）和霜霉菌（Pseudoperonospora cubensis）后，CsZHD家族出現了差異表達，CsZHD8和CsZHD4在接種后顯示出先降低、后升高、再降低的表達模式［27］。本研究通過熒光定量實驗，比較了不同時間處理后的相對表達量。結果表明，在接種炭疽菌后，SgASIL2在接種炭疽菌后顯著下調表達（圖7A），預示其在柱花草抗炭疽菌過程中可能發揮負調控作用，與向小雪［22］的結果類似。SgHAT5（圖7B）和SgZHD8（圖7C）在接種后呈現先下調、后上調、再下調的趨勢，表達趨勢與黃瓜CsZHD4，CsZHD8，葡萄VvZHD8相似，預示本研究中SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8參與了柱花草抗炭疽菌的過程。在60 hpi SgHAT5（圖7B）和SgZHD8（圖7C）的表達量達到峰值，可能與響應炭疽菌的模式有關。

綜上所述，轉錄因子SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8的相對表達量響應炭疽菌的侵染而發生變化，且SgPAL3基因可與轉錄因子SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8結合，但SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8通過調控SgPAL3參與柱花草抗炭疽菌的作用機制還有待進一步研究。

4? 結論

本研究通過構建柱花草的cDNA酵母文庫、酵母單雜交篩庫和點對點驗證實驗證實了3個可與SgPAL3基因啟動子區域互作的轉錄因子：Trihelix家族的SgASIL2，HD-Zip家族的SgHAT5和ZF-HD家族的SgZHD8。熒光定量實驗驗證了柱花草中，SgASIL2，SgHAT5和SgZHD8均響應炭疽菌的侵染。研究結果為進一步解析SgPAL3響應炭疽菌侵染的轉錄調控機制奠定了基礎。

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（責任編輯? 劉婷婷）