低溫促進毛竹葉片類黃酮合成及相關基因的表達模式分析

肖曉燕, 朱成磊, 楊克彬, 劉燕, 李紫陽, 郭棟, 高志民

低溫促進毛竹葉片類黃酮合成及相關基因的表達模式分析

肖曉燕, 朱成磊, 楊克彬, 劉燕, 李紫陽, 郭棟, 高志民*

(國際竹藤中心竹藤資源基因科學與產業化研究所，國家林業和草原局/北京市共建竹藤科學與技術重點實驗室，北京 100102)

類黃酮在植物耐低溫脅迫方面發揮著重要作用，為揭示低溫對毛竹()葉片中類黃酮合成的影響，采用分光光度法測定了不同生長時期和低溫脅迫下毛竹幼苗葉片中的類黃酮含量，通過生物信息學方法對毛竹類黃酮早期生物合成關鍵酶基因進行了鑒定，并用qPCR方法分析了其表達模式。結果表明，隨著葉片的生長，類黃酮含量呈現先升高后降低的趨勢，而低溫下，功能葉片中類黃酮含量則呈現上調趨勢，且在8 h時達極顯著水平。在毛竹基因組中鑒定了類黃酮早期生物合成3個酶基因家族共29個成員，包括20個查爾酮合酶基因(s)、8個查爾酮異構酶基因(s)和1個黃酮-3-烴化酶基因()，這些基因的啟動子中均含有響應低溫及其他非生物脅迫的調控元件。s傾向在根和葉中表達, 而s為組成型表達。在不同生長時期的葉片中，僅表達與類黃酮的含量變化趨勢一致；而低溫脅迫下，3個s、2個s和在功能葉片中呈上調表達，與類黃酮含量變化趨勢一致。因此，毛竹可能通過提高類黃酮早期生物合成酶基因的表達量促進類黃酮的合成來響應低溫脅迫。

毛竹；類黃酮；分子特征；低溫脅迫；基因表達

溫度影響植物的生長發育，低溫脅迫是植物生長發育中最關鍵的非生物脅迫之一。低溫會直接影響植物的光合系統，使植物的生長發育受到抑制, 產生凍害和冷害[1]，嚴重時甚至死亡。葉片是植物最重要的光合器官，同時也是感知外界環境變化較為敏感的器官，能夠及時對低溫環境做出響應。隨溫度降低，冬油菜()的葉面積、氣孔導度、光合速率、蒸騰速率等均逐漸下降[2]。在低溫下，菠菜()葉片的類黃酮總量增加，增強了植株的抗逆性并使糖分積累，葉片中的類黃酮含量與抗寒性的強弱有顯著相關性[3]。枳()實生苗的根系和葉片中的黃烷酮的含量隨著低溫脅迫時間的延長而增加，從而增強抗氧化脅迫的能力[4]。因此，類黃酮在植物應對低溫脅迫方面發揮著重要作用。

類黃酮是植物中一類重要的次生代謝產物，其生物合成途徑前期需要查爾酮合酶(CHS)、查爾酮異構酶(CHI)和黃烷酮-3-羥化酶(F3H)等3個酶家族，后期需要二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)，無色花青素還原酶(ANR)和花青素還原酶(LAR)等4個家族參與，經過一系列反應生成不同種類的類黃酮[5]。研究表明，隨茉莉花()花瓣的顏色變淺，的表達量降低[6]；通過沉默非洲菊()中的，花瓣顏色由粉色變為純白色[7]；通過過表達牡丹()可以改變煙草()花瓣的著色[8]。除了參與花色的形成，類黃酮合成相關酶基因也參與響應逆境脅迫。低溫脅迫下泡核桃()中的顯著上調表達[9]；芹菜()葉柄中的CHI和CHS酶活性在低溫下顯著升高[10]；紅花草莓(×)的表達會隨著溫度的升高而受到抑制[11]；低溫下擬南芥()中、和顯著上調，誘導了花青素的積累[12]。過表達番茄()的能增強煙草的耐冷性[13]。

竹子是重要的森林資源，具有生長快速的特點，其光合作用、初生增粗和筍的木質化等已開展了廣泛研究[14–16]。毛竹()是我國栽培面積最大的竹種，已從葉片組織結構、代謝組和轉錄組方面對其響應低溫進行了分析，找到了類黃酮代謝途徑的差異表達基因[17–18]。另外，研究表明毛竹中可能受不同激素的調控[19]。對七彩紅竹(‘Rainbow’)的研究表明,和在幼嫩紅稈中顯著表達[20–21]。因此，對竹子類黃酮代謝及其酶基因的研究尚不夠深入。本研究以毛竹葉片為材料，研究不同生長時期及低溫脅迫條件下類黃酮含量的變化趨勢，通過生物信息學的方法鑒定毛竹類黃酮早期生物合成的酶基因，明確其分子特征與系統進化關系，并通過qPCR驗證關鍵酶基因的表達模式，以期為深入研究基因的功能提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

將毛竹()種子播種于草炭?蛭石=3:2的基質中，置于約25 ℃的人工氣候室(光16 h/暗8 h，相對濕度約80%)中培養。選擇株高和長勢一致的3個月大小的毛竹實生苗，一部分用于采集不同生長時期的葉片，包括卷葉(S1)、半卷葉(S2)、展葉(S3)和老葉(S4)；另一部分隨機分為4組，每組4盆，置于4 ℃培養箱中模擬低溫脅迫處理。根據葉片類黃酮的含量變化，選擇含量最高時期的葉片作為低溫處理材料，分別在低溫處理0 (對照)、4和8 h后采集葉片，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中用于后續實驗。

1.2 類黃酮含量測定

類黃酮的基本結構是A和C環、B和C環2個共軛體系，用蘆丁標準品繪制標準曲線。首先制備蘆丁標準品母液(1.0 mg/mL)，用60%乙醇稀釋為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL共5個濃度梯度,在510 nm處測定吸光值，以蘆丁濃度為橫坐標, 吸光值為縱坐標繪制標準曲線。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法提取葉片類黃酮并測定吸光度后，根據標準曲線計算類黃酮含量[22]。類黃酮含量(mg/g FW)= (A+0.0049)×÷(1.6277×)×D, 式中,為提取液體積(1.5 mL)；為樣品質量(g)；為稀釋倍數, 未稀釋即為1。

1.3 基因查找與生物信息學分析

利用毛竹最新基因組數據[23]，以水稻()和擬南芥的3個類黃酮生物合成酶家族(CHS、CHI和F3H)的基因序列為誘餌，利用TBtools v1.092軟件[24]內置的BLASN和BLASTX進行同源序列比對，閾值E<10–20?；贜CBI的CDD在線軟件進行保守結構域分析，保留具有完整類黃酮早期生物合成酶基因保守結構域的序列。并對3個類黃酮早期生物合成酶基因家族成員命名。

利用ProtParam (http://web.Expasy.org/protparam/)對類黃酮早期生物合成酶的理化性質進行分析。運用TBtools軟件以及毛竹基因組注釋文件對毛竹類黃酮早期生物合成酶基因的結構進行分析；使用Plant-mPLoc server在線軟件(http://www.csbio.sjtu.edu. cn/bioinf/plant-multi/)進行亞細胞定位的預測[25]。使用PlantCARE (http://bioinformatics.Psb.Ugent.be/web tools/plantcare/html/)對其啟動子序列(2 000 bp)中所含調控元件進行分析預測[26]。

為探究毛竹類黃酮合成酶基因的潛在功能及不同物種間的進化關系，從Phytozome V.12數據庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/)獲得水稻、擬南芥、玉米()和高粱()等物種類黃酮早期生物合成酶的氨基酸序列，利用MEGA 7.0，基于p-distance模型采用鄰接法對毛竹和其他物種的序列進行比對分析，生成系統進化樹[27]，校驗參數為1 000次重復，氨基酸替換模型選用No. of differences[28]。

1.4 組織表達模式分析

從NCBI Short Read Archive下載毛竹組織(鞭、筍、根、葉片、芽和鞘)的26個轉錄組數據(登錄號：SRX2408703～SRX2408728)[23]，篩選其中類黃酮早期合成酶基因的FPKM (fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)，并用Log2(FPKM+1)的值作為基因的表達量，用TBtools軟件進行表達譜熱圖繪制，可視化分析各基因的表達情況。

1.5 葉片中的定量表達分析

選擇關鍵的毛竹類黃酮早期生物合成酶基因,根據其基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計特異定量引物(表1)。用植物RNA提取試劑盒(天漠, TR205-50, 中國)提取RNA，用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA (TaKaRa, RR037A, 日本)。qPCR試驗在qTOWER2.2系統上進行，體系參照Roche Light Cycler?480 SYBR Green I Master kit試劑盒(Roche, 4707516001, 德國)，擴增程序：95 ℃預變性10 min，然后95 ℃變性10 s，60 ℃解鏈10 s，40個循環。選擇作為內參基因[29]，相對表達量采用2–ΔΔCT法[30]計算。

2 結果和分析

2.1 毛竹葉片中類黃酮含量的變化

用蘆丁標準品建立標準曲線，回歸方程為= 1.6277-0.0049，相關系數為2=0.999 9，表明蘆丁在一定的范圍內具有良好的線性關系(圖1: A)。根據蘆丁標準曲線，分別得到不同生長時期和低溫脅迫下毛竹葉片的類黃酮含量。在葉片的4個生長時期，類黃酮的含量存在顯著差異，隨葉片的生長呈先增加后降低的趨勢，且在S3時達到最高(圖1: B)。低溫處理下毛竹S3葉片的類黃酮含量隨脅迫時間的延長而增加，在8 h時顯著高于對照，差異達極顯著水平(圖1: C)，這表明毛竹葉片的生長時期和低溫均會影響類黃酮含量。

表1 實時定量PCR引物

圖1 毛竹葉片的類黃酮含量。A: 蘆丁標準曲線; B: 不同生長時期; C: 低溫處理; S1: 卷葉期; S2: 半卷葉期; S3: 展葉期; S4: 老葉期; **: P<0.01。

2.2 類黃酮早期生物合成酶基因鑒定

毛竹葉片類黃酮的形成受到其生物合成酶基因表達的影響，因此對毛竹中類黃酮早期生物合成酶基因進行了鑒定。經過在毛竹基因組數據庫中比對分析，共獲得29個編碼具有完整保守結構域的類黃酮早期生物合成酶的基因，分別屬于CHS、CHI和F3H家族，分別命名為～、～和?；蚪Y構分析表明，大部分s (14個)含有1個內含子，的內含子數量最多(3個)，、、、和均含有2個內含子；s內含子數量差異很大，有2～13個，其中最多(13個)，最少(2個)，有2個內含子(圖2)。

啟動子序列分析結果表明，s、s和的啟動子序列中包含多種非生物脅迫響應元件，如低溫的LTR、干旱的MBS和缺氧的ARE等(圖3: A)。s和s的啟動子中均有STRE (逆境響應防御)，其中和的啟動子最多(9個)；多數s和s啟動子中含有低溫響應防御元件(MYB-like sequence)、逆境傷害相關(WUN-motif)和真菌誘導(W box)等；4個s和的啟動子中都含有低溫響應元件(LTR)；s和的啟動子中均含有逆境響應防御元件(TC-rich repeats)。此外，在這些序列中還鑒定到其他調控元件，如MYB轉錄因子的結合元件，與激素相關的響應元件等(圖3: B)。這說明類黃酮早期生物合成基因的轉錄可能會受到低溫及其他各種非生物脅迫的影響。

s編碼蛋白長度為368～461 aa，分子量為39.94～50.37 kDa，理論等電點為5.54～9.46，亞細胞定位預測在葉綠體和細胞質中。s編碼蛋白長度為164～400 aa，分子量為18.75～44.92 kDa, 理論等電點為4.83～9.26，預測亞細胞定位均在葉綠體。編碼蛋白長度為363 aa，分子量為40.23 kDa，理論等電點為5.38，預測亞細胞定位在細胞質(表2)?；蚪Y構和蛋白理化性質的差異可能是導致基因功能不同的主要原因。

2.3 PeCHSs和PeCHIs的系統進化

根據水稻中類黃酮早期生物合成CHS的分類構建，毛竹20個PeCHSs聚類在2個組，分別含有2個和18個成員，其中分支I中PeCHS14和PeCHS16分別與已知功能的OsCHS24和OsCHS8高度同源，推測它們可能具有合成查爾酮的功能(圖4: A)；分支II中PeCHSs與OsCHSs各成員存在不同程度的同源性，但功能尚不確定。通過構建毛竹與其他物種CHI的進化分類，PeCHIs在Group I、Group III和Group IV 3個組中(圖4: B)，PeCHI1和PeCHI5與ZmCHI聚類在Group I分支，推測它們具有合成柚皮素的功能。在F3H的進化樹中，毛竹PeF3H1與水稻OsF3H同源性最高，推測它們可能具有相似的功能。

2.4 PeCHSs、PeCHIs和PeF3H1的組織表達特性

組織表達分析在一定程度上能夠驗證基因的功能，根據毛竹26個組織的轉錄組數據分析了類黃酮早期合成酶基因的轉錄水平。3個基因家族的各個成員在同一組織的不同生長時期以及不同組織中的表達模式存在差異(圖5)。s在毛竹的根、筍和葉的部分組織中能檢測到表達，更傾向在根和葉中表達，如、、和僅在葉中高表達，、、和僅在根中高表達；大部分s基因在筍中(除和外)的表達水平較低；而在26個組織中均沒有檢測到。s (除和外)在各個組織中均有表達，它們可能與毛竹整個生長發育過程密切相關。傾向在根和籜片中表達。

圖2 PeCHSs、PeCHIs和PeF3H1的基因結構

圖3 PeCHSs、PeCHIs和PeF3H1啟動子中的順式作用元件(A)和應答元件(B)

表2 PeCHSs、PeCHIs和PeF3H1的基本特征

圖4 基于不同種植物的CHS (A)和CHI (B)家族成員構建的系統發育樹。Pe: 毛竹; Os: 水稻; Zm: 玉米; At: 擬南芥; Gm: 大豆; La: 羽扇豆; Lj: 百脈根; Ma: 紫苜蓿; Ah: 落花生; Ph: 矮牽牛; Dc: 康乃馨; Cs: 茶樹。

2.5 PeCHSs、PeCHIs和PeF3H1的定量分析

植物在不同生長時期和低溫脅迫下的類黃酮含量會發生顯著變化，以適應外界環境。根據系統進化、啟動子元件和轉錄組數據分析，篩選獲得6個代表基因(、、、、和)進行qPCR分析。結果表明，6個基因隨著葉片的生長表達量變化差異較大，其中呈現先升高后降低的趨勢，與類黃酮含量的趨勢相同，在S3達到最高峰，表達量是S1的687.7倍；、和的表達量顯著下調；呈現先下調后上調的表達趨勢，在S4顯著升高，是S1的41.58倍；而的表達則呈現波動變化的趨勢，在S2和S3變化不顯著，在S4時，其表達量顯著上調，是S1的4.57倍(圖6: A)。經過低溫脅迫后，這6個基因均呈現逐漸上升的表達趨勢，且均在8 h達到峰值, 與類黃酮含量表達趨勢一致(圖6: B)。因此，推測他們在毛竹葉片中的類黃酮合成和抵御低溫脅迫中發揮著關鍵作用。

圖5 PeCHSs、PeCHIs和PeF3H1在毛竹26個組織中的表達模式

3 結論和討論

類黃酮化合物廣泛存在于植物體內，是一類重要的次生代謝產物，在植物遭受低溫、干旱等非生物脅迫時，類黃酮合成的相關基因被誘導表達，通過清除活性氧在植物的生長發育和逆境脅迫中發揮重要功能。毛竹廣泛分布于我國長江流域及南方各省區，具有重要的經濟價值，但是溫度制約了毛竹生長和地理分布，尤其是冬季低溫和冰凍雨雪災害的影響尤為嚴重。因此，提高毛竹抵御低溫脅迫的能力是其育種的重要目標之一。本研究通過檢測毛竹葉片中類黃酮含量，包括不同生長時期和4 ℃低溫處理下的功能葉片，發現類黃酮含量發生了明顯變化，表明在毛竹生長發育和低溫條件下類黃酮可能發揮著重要作用。通過分析類黃酮早期生物合成途徑中涉及的酶基因家族成員發現，毛竹CHS家族成員與其它物種相似，不同分支的家族成員可能具有不同的功能。雖然PeCHS13和OsCHS27聚類在一起，但水稻中OsCHS27缺乏2個保守的氨基酸而不具有催化合成類黃酮的功能[31]，因此PeCHSs的具體功能需要進一步研究。PeCHIs家族的成員多于水稻和擬南芥，這與該家族基因發生過復制和擴張有關[23]。Group I中PeCHI1和PeCHI5與玉米和水稻中具有合成類黃酮功能的CHI在同一組；Group III中的CHI屬于脂肪酸結合蛋白(FAPs),PeCHI2、PeCHI3、PeCHI4、PeCHI7和PeCHI8可能影響毛竹細胞中脂肪酸的生物合成及儲存[32]; Group IV作為類黃酮產生的增強劑，PeCHI6可能間接促進類黃酮的生物合成[33]。F3H家族在毛竹中只有1個基因，這與F3H以單拷貝形式存在，在進化上保守[34]一致。

圖6 PeCHSs、PeCHIs和PeF3H1在不同時期(A)和低溫處理(B)葉片中的相對表達量。*: P<0.05; **: P<0.01。

研究表明，類黃酮生物合成酶基因的表達具有發育時期特異性。在大豆中，傾向于在綠葉中表達，而傾向于在子葉中表達[35]。葡萄的在幼葉、幼根、果實和種子中均有表達[36]。銀杏()葉片幼葉時期，雖然分生組織活躍，類黃酮合成快，但由于葉片自身的合成能力有限，因此類黃酮的含量較低；在展葉時期，葉片自身的合成能力強，類黃酮含量較高[37]。在毛竹卷葉中的類黃酮含量最低，功能葉片中的最高，不同時期葉片中僅的表達與類黃酮含量一致，其它類黃酮早期生物合成基因的表達變化差異明顯但沒有規律，和在卷葉時期表達量最高，和在老葉時期表達量最高，這可能與葉片處于不同生長時期以及類黃酮生物合成途徑存在分支有關。

當受到低溫脅迫時，植物體內通過上調表達類黃酮合成酶基因促進其積累來增強植物對低溫的耐受性。對低溫處理的桃樹()葉片進行轉錄組分析表明，類黃酮合成相關基因顯著上調[38]; 低溫促進煙草葉片和苦蕎麥()中類黃酮相關基因上調表達，從而提高類黃酮的含量[39–40]。本研究對低溫處理毛竹葉中類黃酮含量和基因表達的分析也獲得了類似的結果，類黃酮含量及其合成酶基因(3個s、2個s和)的表達隨著低溫處理時間的延長而逐漸增加，且在8 h時達到峰值。然而，除外, 其他類黃酮早期生物合成的關鍵酶基因在不同生長階段葉片中的表達與類黃酮含量變化并不一致，其原因可能與葉片生長發育的復雜調控有關，有待于進一步研究。

本研究在毛竹中共鑒定到3個酶基因家族的29個成員，分別為20個查爾酮合酶基因(s)、8個查爾酮異構酶基因(s)和1個黃酮-3-烴化酶基因()。在基因結構、進化分析、理化性質、順式作用元件和轉錄組數據等生物學分析的基礎上，通過低溫下葉片中類黃酮含量的變化和不同基因的表達差異，初步確定了、、、、和可能是毛竹類黃酮早期生物合成的關鍵酶基因，為進一步解析類黃酮早期合成關鍵酶基因的功能和抗逆基因資源挖掘提供了參考依據。

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Low Temperature Promotes Flavonoid Synthesis and Expression Pattern Analysis of the Related Genes in Leaves of

XIAO Xiaoyan, ZHU Chenglei, YANG Kebin, LIU Yan, LI Ziyang, GUO Dong, GAO Zhimin*

(Institute of Gene Science and Industrialization for Bamboo and Rattan Resources, International Center for Bamboo and Rattan, Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration/Beijing for Bamboo & Rattan Science and Technology, Beijing 100102, China)

Flavonoids play an important role in plant resistance to low temperature stress. To reveal the effects of low temperature on flavonoid synthesis in leaves of, the content of flavonoid in leaves of bamboo seedlings at different growth stages and under low temperature stress was determined by spectrophoto- metric method, the key enzyme genes of early biosynthesis of flavonoid in bamboo were identified by bioinfor- matics methods and their expression patterns were analyzed using qPCR. The results showed that the flavonoid content increased at first and then decreased, while that in the functional leaves increased under low temperature and reached significant level at 8 hours. There were a total of 29 members, belonging to three gene families, involved in early biosynthesis of flavonoid in., including 20 chalcone synthase genes (s), eight chalcone isomerase genes (s) and one flavanone-3-hydroxylase gene (), the promoters of these genes all containedregulatory elements in response to low temperature and other abiotic stress responses. Thes tended to be expressed in roots and leaves, whiles expressed constitutively. Only the expression trend ofwas consistent with the content of flavonoid in.leaves at different growth stages, while six key enzyme genes (3s, 2s and) were upregulated continuously in functional leaves under low temperature, which was consistent with the change trend of flavonoid content. Therefore,might respond to low temperature stress by increasing the expression of genes involved in early biosynthesis of flavonoid.

; Flavonoid; Molecular characteristics; Low temperature stress; Gene expression

10.11926/jtsb.4717

2022-08-16

2022-10-02

國家重點研發計劃項目(2021YFD2200502)資助

This work was supported by the National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2021YFD2200502).

肖曉燕(1996年生)，女，碩士研究生，研究方向為毛竹生長發育的分子基礎研究。E-mail: xiaoxiaoyan@icbr.ac.cn

* 通訊作者 Corresponding author. E-mail: gaozhimin@icbr.ac.cn